成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠模型的建立与鉴定

去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是一种能够水解30余种跨膜蛋白质的"脱落酶"(sheddase),参与诸多生理过程和致病机制,如胚胎发育、细胞粘附、信号转导、免疫反应、癌症和阿尔茨海默病。迄今,已报道的ADAMIO完全基因敲除小鼠和大脑神经前体细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠分别于胚胎期或围产期死亡,致使无法研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能。文章利用本研究小组建立的CaMKlla-Cre转基因小鼠与ADAM10loxP/loxP转基因小鼠杂交,获得了CaMKIIα-Cre/ADAM10loxP/loxP小鼠,并对其进行鉴定。利用PCR方法检测成年ADAM10cKO小鼠大脑基因组DNA表明,ADAM10基因缺失主要发生在前脑皮层和海马中。荧光定量PCR检测结果显示,ADAM10 mRNA的表达水平在前脑皮层和海马中分别降低55.7%和60.8%;使用Western blotting方法研究发现,ADAM10成熟蛋白质的含量在前脑皮层和海马中分别减少63%和84.8%。采用免疫组织化学方法检测表明,成年ADAM10cKO小鼠与野生型小鼠相比,其大脑皮层和海马神经细胞的ADAM10免疫染色明显减弱,而其它细胞如胶质细胞的免疫染色基本一致。总之,文章成功制备了首个存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除(cKO)小鼠,克服了小鼠因ADAM10缺失在胚胎期或围产期死亡的弊端,为研究成年小鼠大脑神经细胞ADAMIO基因的功能奠定了坚实的基础。

CaMKⅡα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建

目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列,构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8.1kb的调控区DNA片段,该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后,依次与pCre-IRES-EGFP质粒框架连接,构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致,其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端,构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础,有助于神经系统相关疾病的研究。

成年小鼠大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除的认知功能研究

目的探讨成年小鼠大脑神经细胞特异性ADAM10基因缺失后对小鼠行为的影响。方法通过Y迷宫、高架十字迷宫以及旷场实验,了解ADAM10基因敲除后,对小鼠的自主活动能力、探究学习能力的影响。结果行为学实验结果显示ADAM10基因敲除小鼠的自主活动能力较对照组小鼠有所下降,其在新环境中探索的次数、时间和路程较对照组明显减少。说明了脑内神经细胞ADAM10基因的缺失对成年小鼠的自主活动能力和探究学习能力都产生了一定的影响。

抽取小鼠脑脊液简便易行的新方法

目的建立抽取小鼠脑脊液的一种简单易行,材料低廉,生存率与成功率高的方法,为小鼠脑脊液的相关研究提供参考。方法自制微量吸管。将小鼠头部固定与身体大约成120°角,对小鼠皮下组织和肌肉用镊子进行钝性分离,找到小鼠白色硬脊膜,进管抵达小脑延髓池,缓慢抽取小鼠脑脊液并将管退出,最后缝合小鼠伤口。结果成功获得小鼠脑脊液2~5μL,小鼠存活。讨论目前,大多文献记载的是大鼠脑脊液的抽取方法或较为复杂的小鼠脑脊液抽取方法,而此种针对小鼠的脑脊液抽取方法不但简单易行,对仪器要求低,成功率高而且小鼠生存率高,可以反复抽取。

小鼠ADAM10条件性基因打靶载体的构建与鉴定

目的构建小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法以正常小鼠(129/Svj)基因组DNA为模板,采用长片段PCR方法,扩增小鼠ADAM10基因第2外显子及其侧翼序列。通过引入LoxP位点和TK基因等步骤,获得ADAM10条件性基因打靶载体。结果经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的小鼠ADAM10基因条件性打靶载体符合设计要求。结沦成功构建了小鼠ADAM10条件性基因打靶载体,为建立ADAM10条件性基因敲除小鼠打下了基础。

实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量PCR方法检测CaMKⅡα-Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法以CaMKⅡα-Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象,利用绝对定量的实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠的拷贝数,并筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果绝对定量标准曲线公式为:△Ct=-2.402log5N(拷贝数)+8.654,相关系数为0.9999,扩增效率为95.4%。三只CaMKⅡα-Cre首建鼠的拷贝数分别为19、7、5;三个转基因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法,该方法可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。