人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .

丹红注射液对缺血性中风大鼠舌象的干预研究

目的观察丹红注射液干预缺血性中风大鼠舌象的作用,为其临床应用提供依据。方法制备缺血性中风大鼠模型,进行神经行为学评分,以丁苯酞注射液为对照,观察丹红注射液对舌象的干预作用。对舌腹面、舌背面拍照记录并分析血瘀证相关舌象。舌色的R、G、B值由Photoshop5.0软件获得,根据标准色卡进行校正计算获得校正R、G、B值。根据舌下脉络的色泽和长短进行评分。进行TTC染色脑梗死体积测算,分析两者相关性。结果模型大鼠舌色校正R、G、B值与脑梗死体积均密切相关(分别为P <0.05,P <0.01,P <0.01)。丁苯酞组、丹红注射液组均能改善模型大鼠舌色,校正R、G、B值显著高于模型组(分别为P <0.01,P <0.05,P <0.05),显著改善舌下脉络色泽,显色长度缩短(均P <0.01);两个治疗组神经行为学评分较模型组显著下降(均P <0.05),梗死灶显著缩小(均P <0.01)。以上指标在丁苯酞及丹红注射液组之间无明显差异(P> 0.05)。结论丁苯酞、丹红注射液均能显著改善缺血性中风大鼠血瘀证相关舌象,促进神经功能恢复,缩小梗死灶。

人细胞色素P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的 :获得纯化抗原用于制备CYP2B6多克隆抗体。方法 :PCR扩增目的基因片段 ,亚克隆入融合蛋白表达载体pGEX - 3b ,构建了重组质粒pGEX/ 2B6。然后将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE分离 ,获纯化融合蛋白GST - 2B6。用GST - 2B6免疫BALB/C小鼠 ,自腹水中获取CYP2B6多克隆抗体 (2B6pAb)。结果 :融合蛋白GST - 2B6 (CYP2B6 2 0 2～ 35 2aa) ,并获其特异的多克隆抗体。结论 :通过构建融合蛋白重组表达质粒pGEX/ 2B6 ,用获得的初步纯化融合蛋白GST -

小鼠半相合移植物抗宿主病体内、外实验体系的建立及应用

[目的]建立观察小鼠移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease,GVHD)的体、内外实验体系。[方法]体外实验体系包括MTT法观察单向混合淋巴反应(MLR)中供鼠淋巴细胞增殖;采用PHA活化供鼠T淋巴细胞,Annexin V/PI双染法检测T细胞凋亡率,观察细胞周期变化及不同时间的CD25和CD69表达率。选择经典GVHD防治药物环孢菌素A(cyclosporin A,CSA)和地塞米松(dexamethasone,Dexa)验证体外实验体系的有效性。以CB6F1为受鼠,60Co全身照射清髓,输入供鼠的骨髓和脾细胞,建立稳定的小鼠半相合骨髓移植GVHD模型,为体内实验体系,观察GVHD的程度、生存期及CSA和Dexa的疗效。[结果]CSA和Dexa能显著抑制单向MLR中供鼠效应T淋巴细胞增殖,诱导PHA活化后T淋巴细胞凋亡率增加。CSA和Dexa对T细胞的细胞周期影响包括亚二倍体凋亡峰的比例明显增加、G0/G1期比例增加和S期比例减少。CSA和Dexa还能降低GVHD同种反应T细胞的标志CD25和CD69的表达。建立稳定的小鼠半相合骨髓移植GVHD模型,CSA和Dexa均能减轻GVHD的程度,延长生存期,以CSA为佳。[结论]形成体外观察供鼠GVHD同种反应T细胞增殖、活化的实验体系,建立稳定的小鼠GVHD模型,采用CSA和Dexa验证了其药物筛选的有效性。

高白细胞性急性髓系白血病细胞基因表达谱的研究

[目的]综合分析高白细胞性急性髓系白血病不同预后患者祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性以及差异表达的基因。[方法]半固体集落形成法观察不同预后患者骨髓祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性。采用Affymetrix公司人类寡核苷酸表达谱芯片检测患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱,筛选出差异表达数据。[结果](1)患者骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性与预后密切相关,未缓解者的骨髓祖细胞集落明显高于完全缓解患者,且对化疗药物不敏感。(2)完全缓解患者白血病细胞表达上调2倍以上的基因109条,占0.5%。下调2倍以上的基因134条,占0.6%,其中与预后密切相关的为TRIM16、TM4SF1。CD34和DNMT3B。(3)差异表达的基因按功能分成离子通道运输、细胞周期、细胞骨架运动、细胞凋亡等14类。上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类。[结论]特定的基因表达模式决定患者预后。

人参皂甙对红系、粒单系、巨核系细胞株的增殖及转录因子的诱导作用

目的 :通过观察人参皂甙 (GS)对c fos、GATA 1转录因子的诱导作用 ,探讨GS在造血细胞内的作用机理。方法 :选用粒系细胞株HL 60、单核细胞株U937、红系细胞株K562和巨核系细胞株Meg 0 1作靶细胞 ,MTT法和祖细胞集落培养法观察GS的增殖效应 ;用WesternBlot来分析核蛋白抗原与c fos、GATA 1抗体的结合反应。结果 :( 1)MTT法和祖细胞集落培养法均显示GS( 10 μg/ml)能够明显地刺激三系细胞增殖 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 5)。 ( 2 )WesternBlot分析表明HL 60、K562和Meg 0 1细胞经GS处理后核内c fos转录调控蛋白量分别是未经处理细胞的 1 5、2 0和 2 5倍 ,但U937细胞不表达c fos蛋白。 ( 3)除了U937细胞不表达GATA 1蛋白外 ,其他细胞株经GS刺激后GATA 1转录调控蛋白量分别是处理前的 1 5、2 1和 1 3倍。结论 :GS能够明显地刺激 3种系列的细胞株增殖 ,并能有效地通过诱导c fos或GATA 1转录因子而调控造血细胞与增殖或分化有关基因的表达。

人参二醇促骨髓CD34^+细胞增殖和分化的研究

本研究探讨人参二醇(PDS)对正常人骨髓CD34+细胞的促进增殖和诱导分化作用。用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34+细胞,采用琼脂半固体多向祖细胞集落(CFU-Mix)培养方法观察PDS对CD34+细胞的增殖作用;用液体培养使CD34+细胞增殖,并向红系、粒系定向生长,用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化。结果显示:免疫磁珠分离CD34+细胞的获得率占骨髓有核细胞(MNC)的(1.0±0.15)%;活细胞比例占(95.6±1.2)%,CD34+细胞富集度达(86.8±2.8)%。中浓度PDS(25mg/L)能够有效地促进CD34+细胞增殖,生成CFU-Mix集落,提高率为(56.3±3.5)%,与对照相比较有显著差异(p<0.01)。液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高,与对照相比差异有显著性,提高率分别为(35.6±3.2)%和(22.3±2.1)%,与对照相比差异有显著性(p<0.01),且呈剂量依赖性。经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高,CD33+细胞在PDS50mg/L时最高,CD71+细胞在25mg/L时最高,G-A+细胞在10mg/L时最高,而CD15+细胞数量无明显变化。结论:PDS不但促进CD34+细胞增殖,且能诱导其定向分化,提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。

三七总皂苷诱导造血细胞基因表达谱的体外实验研究

目的采用cDNA芯片技术分析三七总皂苷(PNS)诱导造血细胞的基因表达谱,探讨上调基因与细胞增殖、分化的相关性。方法选择增殖、分化相关重要的功能基因480个,制备cDNA膜芯片。人造血细胞巨核系CHRF-288、粒系HL-60和红系K562细胞经PNS处理后,分别提取mRNA,经逆转录后用〔α-33P〕dATP标记,与芯片的cDNA杂交。结果PNS诱导表达上调3倍以上的基因按功能分11类,包括甲基和乙酰化转移酶、诱导分化、抑制凋亡、转录调控蛋白、周期蛋白、信号传递介导蛋白和激酶、受体、DNA和RNA聚合酶,以及大鼠肉瘤(RAS)基因家族等。PNS诱导CHRF-288、HL-60和K562细胞后,mRNA表达水平上调3倍以上的基因分别为78条、89条和59条,占检测基因总数的16.3%、18.5%和12.3%。结论PNS诱导上调的基因均与细胞增殖和分化相关,与我们报道的血液病动物模型、造血干/祖细胞、基因转录调控和蛋白激酶等研究结果相符,为PNS的作用提供了基因表达谱方面的有力证据。

升血灵胶囊(人参总皂苷)治疗免疫性血小板减少症的临床研究

[目的]观察升血灵胶囊(人参总皂苷)对免疫性血小板减少症(ITP)患者的疗效。[方法]68例诊断明确的慢性ITP患者,均由免疫异常所致。升血灵胶囊治疗组48例采用升血灵胶囊口服;对照组20例采用常规药物肾上腺皮质激素治疗,疗程均大于2个月。[结果]升血灵胶囊治疗48例ITP的有效率达89.58%,外周血小板计数(PLT)提高(42.5±36.8)×109/L,并且未观察到明显的副作用。其中原发性ITP 32例的有效率90.63%,继发性ITP 16例的有效率87.50%,而对照组有效率40.00%(8/20),PLT计数提高(26.1±29.0)×109/L,均明显低于升血灵胶囊治疗组(P<0.01)。[结论]升血灵胶囊治疗慢性ITP的疗效良好,能够有效地升高血小板数,且未见明显副反应,为ITP提供了安全有效的中药新药。

大黄素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨大黄素对人白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。方法:应用MTT法检测大黄素对HL-60细胞增殖的影响;应用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡;蛋白印迹法(Western-Blot)检测Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果:在5～20mg/L浓度范围内,大黄素对HL-60细胞增殖的抑制作用呈时间剂量依赖性20mg/L作用72h后,抑制率分别达到(19.8±2.7)%,(58.8±4.4)%和(73.8±5.7)%;流式细胞术检测发现:大黄素5、10和20mg/L作用24h后,细胞凋亡率分别为(15.5±3.4)%、(56.0±3.4)%和(71.1±5.0)%,与对照组(1.01±0.06)%有显著性差异(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯形条带。大黄素作用24h后,Bcl-2蛋白的表达水平随药物波度增加呈逐渐下降趋势。结论:大黄素能够抑制HL-60细胞增殖,并诱导其凋亡。Bcl-2基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程。

人参皂苷对桥本甲状腺炎大鼠Foxp3、T-bet、GATA-3 mRNA表达的影响

[目的]观察人参皂苷对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺Foxp3、T-bet、GATA-3 m RNA表达的影响。[方法]40只Wistar大鼠随机分为五组,即正常组、桥本甲状腺炎模型组、人参皂苷低、中、高剂量组,治疗组人参皂苷灌胃,正常及模型组以蒸馏水灌胃。用酶联免疫法检测甲状腺自身抗体水平,HE染色观察甲状腺组织病理改变,RT-PCR检测甲状腺组织Foxp3(Forkhead/winged helix transcription factor,叉状头/翅膀螺旋转录因子)、T-bet(T-box expressed in T cells,转录因子T-bet)、GATA-3(GATA binding protein 3,转录因子GATA-3)的表达。[结果]与正常组相比,模型组的TGAb(Thyroglobulin,甲状腺球蛋白抗体)及TPOAb(Thyroid peroxidase antibody,甲状腺过氧化物酶抗体)水平显著增加(P<0.05),T-bet m RNA表达水平也显著增加(P<0.05),Fox P3、GATA-3 m RNA表达显著下调(P<0.05);与模型组相比,人参皂苷治疗组的TGAb及TPOAb均下降,同时T-bet m RNA表达下降,其中低剂量与中剂量组有统计学意义(P<0.05),而人参皂苷治疗各组的GATA-3、Foxp3的表达水平均有所上升,其中低剂量与中剂量组有统计学意义(P<0.05)。[结论]Fox P3、GATA-3 m RNA表达下调,T-bet m RNA表达上调可能是桥本甲状腺炎发病的重要原因之一。人参皂苷可能通过上调GATA-3、Foxp3的表达,下调T-bet的表达,抑制Th1细胞功能的过度亢进,调节免疫的途径来保护甲状腺组织。

免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变

[目的]探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞(msenchymal stem cell,MSC)向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。[方法]采用免疫介导法进行再障造模,Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后,自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型;造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养,并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)数量变化,观察模型小鼠骨髓病理改变;茜素红和油红O分别检测模型小鼠MSC钙结节数和脂肪细胞形成率。[结果]再障模型小鼠CFU-F数明显减少;骨髓病理切片显示,造血组织减少,并脂肪化;再障小鼠MSC钙结节数量减少,脂肪细胞分化率显著增加。[结论]免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱,成脂潜能明显增强。

人参皂甙对白血病耐药细胞化疗药物敏感性的研究

目的 :通过观察人参皂甙 ( GS)协同化疗药物对 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr白血病耐药细胞株的抑制作用 ,探讨 GS是否能提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性。方法 :选用 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr两耐药细胞株作为靶细胞 ,液体培养和半固体集落培养法观察不同浓度的 GS对耐药细胞增殖的影响 ,及 GS协同化疗药物对 K5 62 /VCR、K5 62 /Adr耐药细胞集落生成的抑制作用。结果 :1单用 GS作液体培养 MTT分析法和集落培养法均显示低、中等浓度的 GS5～ 5 0 μg/ml对细胞增殖无明显影响 ,但当浓度升高至 75 μg/ml时 ,则抑制细胞增殖和集落形成 ( P<0 .0 1 )。2当 GS与化疗药物联合应用时 ,即使化疗药物浓度 ( 1 μg/ml)不变 ,K5 62 /VCR、K5 62 /Adr耐药细胞对化疗药物的敏感性与 GS呈剂量依赖关系。即 GS浓度达到 5 0μg/ml时 ,化疗药物对细胞的抑制作用明显 ( P<0 .0 1 ) ,且随着 GS浓度的升高 ,抑制作用逐渐增强。结论 :GS通过提高耐药细胞对化疗药物的敏感性而与化疗药物起协同作用 ,同时在一定浓度下 。

人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的PC12细胞损伤的作用

目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的大鼠嗜铬细胞瘤损伤的影响。方法以大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞为研究对象,以鱼藤酮(0.3、1、3、10、30μmol/L)或MPP+(0.1、0.3、1、3mmol/L)诱导细胞损伤。设阴性对照组、人参二醇对照组(10、25、50、75、100mg/L)、鱼藤酮(3μmol/L,24h)或MPP+(1mmol/L,48h)组,人参二醇(10、25、50、75、100mg/L)联合鱼藤酮(3μmol/L)或MPP+(1mmol/L)组。采用MTT法检测细胞增殖活性;PI和Hoechst 33342染色检测细胞坏死和凋亡;并以免疫组织化学测定细胞酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果人参二醇(10、25、50、75、100mg/L)本身不会抑制PC12细胞增殖,其中50、75mg/L人参二醇还可促进细胞增殖;各浓度人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤均不具有保护作用;在MPP+处理诱导细胞损伤后,50、75mg/L人参二醇可提高细胞增殖活性,但人参二醇对细胞凋亡和坏死及TH的表达无影响。结论人参二醇(50、75mg/L)对MPP+诱导的PC12细胞损伤有保护作用,其作用机制与促进细胞增殖有关;人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤无明显保护作用。

对病毒性肝炎相关血小板减少性疾病中医治疗体会

病毒性肝炎相关的血小板减少性疾病是血液系统疾病中的常见病,在各类肝病中发生率较高。西医目前的治疗手段比较局限,易产生耐药,且会引起血小板的进一步减少,从而给患者带来更大的风险。中医认为本病的病位主要在脾,与肝有关,久则及肾;故治疗上以脾为中心,兼顾肝肾,从整体上进行辨证论治,抓住不同病人血小板减少引起出血的主要病机,进行综合治疗,可以取得较好的临床疗效。

人参二醇对鱼藤酮MPP＋诱导的BV2细胞活性下降的作用

目的观察人参二醇对鱼藤酮、MPP＋诱导的小鼠小胶质细胞活性下降的影响。方法以小鼠BV2细胞为研究对象，以鱼藤酮（0．03、0．1、0．3、1、3μmol／L）或MPP＋（10、30、100、300、1000μmol／L）处理24h和诱导细胞活性下降。设阴性对照组、人参二醇对照组（100mg／L），鱼藤酮（0．1μmol／L）或MPP＋（100μmol／L）损伤组，人参二醇治疗组（10、25、50、75、100mg／L）。采用MTT法检测细胞活性。结果各浓度人参二醇对BV2细胞的活性无明显影响。鱼藤酮或MPP＋处理24h可诱导BV2细胞活性下降，各浓度人参二醇不能逆转鱼藤酮或MPP＋造成的细胞活性下降。结论人参二醇对鱼藤酮或MPP＋诱导的BV2细胞活性下降无保护作用。

七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究观察七叶皂苷对髓系白血病HL-60细胞的抑制和诱导凋亡作用。取对数期生长的HL-60细胞经饥饿处理后,加入不同浓度的七叶皂苷观察七叶皂苷抑制细胞生长的指数、形态学变化,用DNA片段凝胶电泳(DNA Ladder)和Annexin V/PI-FITC双标法分析诱导细胞凋亡的作用。结果表明:七叶皂苷抑制HL-60细胞生长,15-120mg/L的七叶皂苷处理细胞48小时后,存活率为(92.2±0.69)%-(8.2±0.96)%,均明显低于不加药的对照组(99.4±0.31)%(p均<0.05);七叶皂苷15-60mg/L处理细胞24小时后细胞发生凋亡。Annexin V/PI分析显示,给药组AnnexinV阳性细胞为(12.7±0.58)%-(65.4±1.30)%,明显高于对照组的(0.57±0.03)%(p均<0.01)。七叶皂苷处理的细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示典形的凋亡DNA梯形条带。结论:七叶皂苷能特异性地诱导HL-60细胞凋亡,此研究结果为七叶皂苷今后作为治疗白血病的辅助药物提供实验依据。

蚕砂提取物治疗再生障碍性贫血作用机制

再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）简称再障,一种自身免疫性疾病,主要临床表现为进行性贫血、发热及出血。中药治疗再障有明显的疗效[1]。中药蚕砂又名蚕矢,性味甘温,入肝、脾、胃经,有燥湿、祛风和胃化浊、活血定痛、养血化瘀之功。现就中药蚕砂提取物调节再障的发病机制做此综述。1中西医对再障发病的认识1.1西医对再障发病的认识再生障碍性贫血是由于骨髓造血微环境的缺陷,

七叶皂苷钠诱导人单核白血病SHI-1细胞凋亡的研究

目的研究七叶皂苷钠对人急性单核白血病细胞株SHI-1细胞的抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法 SHI-1细胞经不同浓度的七叶皂苷钠处理后,MTT法分析七叶皂苷钠对SHI-1细胞增殖的抑制作用,AnnexinⅤ/PI染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,DNA凝胶电泳观察凋亡特异性DNA降解梯形条带,半定量PCR检测凋亡特异性酶Caspase-3 mRNA表达水平。结果MTT法显示七叶皂苷钠能显著抑制SHI-1细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。经不同浓度的七叶皂苷钠处理24h,AnnexinⅤ/PI染色显示AnnexinⅤ阳性的凋亡细胞率明显上升,DNA琼脂糖凝胶电泳分析出现凋亡特异性的DNA降解梯形条带,半定量PCR显示Caspase-3 mRNA表达水平随药物浓度增加而升高(P<0.05)。结论七叶皂苷钠对SHI-1细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,可能是其抗白血病作用途径之一。

清热解毒方在再生障碍性贫血中的应用

再生障碍性贫血(AA)目前仍是血液系统难治性疾病之一,尤其是急性再生障碍性贫血(AAA),其发病急,病情重,治疗难度大[1].清热解毒中药方治疗再障,尤其是治疗急、重型再障方面已经取得较好的疗效,本文对清热解毒中药方治疗AA的应用及作用机制进行综述.