HBV X基因对成人肝细胞HL-7702线粒体功能的影响

目的:研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。方法:将HBV X基因真核表达载体pCDNA3-X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL-7702细胞,经过2周G418筛选,获得稳定表达的新细胞株,分别命名为HL-7702/HBx和H-7702/pcDNA3,RT-PCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL-7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RT-PCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COXⅢ表达水平变化,并通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性。结果:重组质粒pcDNA3-X转染后经G418筛选,RT-PCR和Western blot分析结果显示HL-7702-HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RT-PCR和Western blot结果发现HBV X基因下调COXⅢ蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低。结论:HBV X基因通过转录后水平调节COXⅢ表达,HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性。

HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的 :研究HBVX基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响。 方法 :用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3 /HBx瞬时转入HepG2细胞 ,以未转染的HepG2细胞及转染空载体 pcDNA3 的细胞为对照。RT PCR法检测HBx基因的表达 ;MTT法检测各组细胞的增殖活性 ;TUNEL法检测各组的凋亡情况。β actin为内参 ,半定量RT PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl xL、c myc的表达量变化。结果 :pcDNA3 X转染HepG2细胞后 ,RT PCR扩增出HBVX片段 ,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段。HepG2细胞转染HBx基因后 ,相对于对照组细胞增殖能力明显下降 ,凋亡增多 ,差异有显著性意义 (P <0. 0 1) ;转染HBx的细胞Bax、Bcl xL、c mycmRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高 ,差异有显著性意义 (P <0 . 0 5 )。结论 :成功将HBx基因转染入HepG2细胞 ,并在细胞中表达 ,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl xL、c mycmRNA表达 ,促进HepG2细胞凋亡 ,抑制增殖。

乙型肝炎病毒X基因在Hep G2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响。 方法 用分子克隆方法构建HBVX真核表达载体 pcDNA3 X ,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞 ,以转染空载体 pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照 ,抽提RNA ,进行RT PCR ,检测HBVX基因的表达。以 β actin为内参 ,用半定量RT PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasLmRNA相对表达量的变化。 结果 重组真核表达载体经RT PCR及DNA测序均检测出HBVX特异性片段 ,pcDNA3 X转染HepG2细胞后 ,RT PCR扩增出HBVX片段 ,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段。转染HBx的细胞Fas与FasLmRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高 ,差别有统计学意义 (P <0 0 5 )。 结论 成功构建HBVX真核表达载体 pcDNA3 X ,转染入HepG2肝癌细胞 ,并在该细胞中表达。HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达。

血清CEA、CA15-3和CA19-9联检对胃癌患者手术后的临床价值

本文对胃癌患者手术治疗前后进行血清CEA、CA15-3、CA19-9联检，现报告如下。

表皮生长因子受体和整合素通路交叉作用对胃癌细胞侵袭的影响

目的了解表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和整合素信号通路在胃癌细胞SGC7901中的交叉反应和对细胞侵袭增殖的影响。方法使用EGF和Fn刺激SGC7901细胞,免疫沉淀和蛋白质电泳检测ERK、FAK和p130cas总蛋白和FAK Y397、p130cas Y410和ERK总酪氨酸磷酸化的改变;使用改良Boyden小室法检测胃癌细胞侵袭力;MTT法检测细胞增殖的改变;使用RNA干扰降低FAK表达,观察FAK低表达对交叉反应和胃癌侵袭增殖的影响。结果 ERK、FAK和p130cas总蛋白在刺激前后无变化(P>0.05)。Fn刺激后,ERK总酪氨酸磷酸化增强了2.90倍(P<0.05),细胞侵袭力增强了2.36倍(P<0.05),24 h MTT值升高了1.68倍(P<0.05);EGF刺激后,FAKY397磷酸化增强了2.75倍(P<0.05),p130cas Y410磷酸化增强了4.33倍(P<0.05),细胞侵袭力增强了1.50倍(P<0.05),24 h MTT值分别升高了1.76倍(P<0.05)。转染FAK siRNA组细胞,FAK Y397磷酸化表达只有对照组的0.30倍(P<0.05);Fn刺激后,ERK总磷酸化表达只有对照组的0.66倍(P<0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.37倍(P<0.05),24 h MTT值只有对照组的0.63倍(P<0.05);EGF刺激后,p130 Y410磷酸化只有对照组的0.49倍(P<0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.48倍(P<0.05),24 h MTT值只有对照组0.77倍(P<0.05)。结论 EGFR和整合素信号在胃癌细胞中发生交叉反应,FAK是其中的关键信号分子,阻断FAK表达可以有效抑制两条信号通路引起的胃癌细胞侵袭和增殖。

内镜与X线联合放置食管支架治疗食管恶性狭窄初探

目的探讨内镜联合X线放置食管支架治疗食管恶性狭窄的临床意义。方法13例食管恶性狭窄患者采用内镜联合X线放置国产带膜网状镍钛合金记忆支架,规格为Ⅱ型,喇叭口或球头支架,架体直径18～20mm,支架有硅胶膜覆盖,支架置入器外径8mm,支架上下端各超出狭窄段2cm。结果13例患者放置食管支架一次性成功,支架置入后梗阻即刻缓解,所有患者术后均有不同程度不适,2例患者疼痛较为激烈,发生率为15.4%(2/13);3例患者出现反流性食管炎,发生率为23.1%(3/13);5例患者发生术后再狭窄,发生率为38.5%(5/13)。本组病例无一例发生术后大出血及支架移位,未发生食管穿孔等严重并发症。结论内镜联合X线放置食管支架治疗食管恶性狭窄,使支架置入更加安全、准确和便捷,具有良好的临床应用价值。

HBV X基因和X蛋白的功能

HBVX基因编码的X蛋白(PX)是一种多功能蛋白,在HBV感染和肝细胞癌(HCC)发展的不同阶段,执行不同的生物学功能.PX参与调节病毒复制,显著影响肝细胞信号传导、新陈代谢、凋亡、细胞因子产生、细胞周期调控和癌基因、抑癌基因等方面基因表达,干扰线粒体氧化磷酸化等能量代谢过程,造成细胞氧化损伤,促进细胞凋亡.

乙型肝炎病毒PreS1蛋白与初期多肽相关复合体α亚单位特异性结合的研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreS1蛋白与人类初期多肽相关复合体α亚单位(nascent-polypeptide-asso-ciated complex alpha polypeptide,NACA)之间的结合作用。方法采用交合实验验证PreS1蛋白和NACA在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实二者在体外的结合作用,免疫共沉淀实验证实二者在哺乳动物细胞中的特异性结合。结果携带NACA基因的酵母同携带preS1基因的酵母交合后发生反应,LacZ活性检测菌落呈现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示PreS1蛋白和NACA在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在13×103处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能检测到PreS1蛋白和NACA的特异结合。结论NACA与PreS1蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,推测NACA可能通过与PreS1蛋白的结合影响病毒黏附及反式激活等过程。

基层事业单位适应财政制度改革和自身发展对策

2011年度广东省年度部门决算报表编制工作出现了较大的变化，编制的报表中首次出现了《省直部门财务明细信息表》，同时取消了《基本建设支出报表》，取而代之的是《固定资产投资决算报表》。决算报表的变化预示着作为全国试点的广东省将把政府会计改革工作全面铺开，本文拟对基层事业单位如何适应新形势新要求新变化，满足使用者需求和财政需求促进自身发展进行探讨，并提出一些对策。

企业知识库建设模式探索

通过对企业知识库建设的文献调研发现,目前,对企业知识库建设存在两种模式,一是以技术为主导的企业知识库建设模式;二是以知识为中心的企业知识库建设模式。这两种模式都体现出不同时代发展的特征,面对新的知识经济时代,这两种模式都暴露出各自在实际建设中的不足,无法解决知识库知识共享的难题,阻碍协同合作的实现。从研究现状及存在的不足发现,企业知识库的建设应转移到对用户(企业员工)的重视上,从用户的角度着手,寻求知识库知识共享与协同合作的解决方案。

表达HBVX基因的小鼠模型的建立及对肝细胞凋亡因子的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒X(HBVX)基因及其产物对肝细胞凋亡相关基因表达的影响.方法:将实验用SPF级成年♂KM小鼠分为实验组、空质粒对照组、生理盐水对照组.实验组以构建好的PCDNA3.1-HBVX质粒,空质粒对照组以PCDNA3.1质粒,生理盐水对照组以生理盐水,通过尾静脉高压注入动物体内,在第48小时处死小鼠后,取肝组织,以RT-PCR,凝胶回收测序及Westernblot检测HBVX表达,以RT-PCR半定量检测小鼠肝组织内bax、c-myc及bcl-2的表达.结果:实验组RT-PCR显示465bp处有清楚条带,肝组织内有HBVXmRNA的存在,两对照组无HBVXmRNA存在,Western blot检测实验组有HBVX蛋白的表达;两对照组则无HBVX蛋白表达.通过对小鼠肝组织凋亡相关因子的半定量RT-PCR,相对于空质粒对照组和生理盐水对照组,转染HBVX基因的小鼠肝组织bax、c-myc及bcl-2的mRNA相对表达量明显增高,差异有显著性意义(bax:1.3127±0.0900vs1.0023±0.1670,0.9094±0.1081;c-myc:1.6294±0.0672vs1.2869±0.0880,0.9757±0.0397;bcl-2:1.5567±0.1257vs0.6856±0.1554,0.5488±0.1278,均P<0.05).结论:成功建立了表达HBVX的小鼠动物模型,并证明转染HBVX基因后小鼠肝脏组织内bax、bcl-2及c-myc的mRNA表达同时上调.

新形势下水利经济责任审计存在的问题及解决措施

随着水利在经济社会发展中的地位日显重要,中央及地方对水利资金投入的逐步加大,水利行业内的经济责任审计工作面临着机遇和挑战,本文围绕目前水利行业内部经济责任审计的特点和存在问题进行探讨,并提出一些对策。

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率。方法采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,jet-PEI转染试剂与三质粒共转染293T细胞后浓缩、计算慢病毒颗粒的滴度;用慢病毒液感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,120 h后初步观察慢病毒颗粒的感染情况。Real-time PCR和Western blot法检测细胞HBV X基因的表达。结果成功构建HBV X基因的慢病毒表达载体质粒pRRL-X。经293T细胞包装后,用慢病毒感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,120 h后被感染的细胞内可见强弱不等的荧光。结论成功构建HBV X慢病毒表达载体。

连锁终端失控 速度的苦果?

像篮球明星之于NBA，要将终端连锁店对连锁总部的依赖程度提高到无可复加的地步。

日本的专业主妇

大学毕业后,在外企工作了近六年,两年前辞去高级主管的职务,随丈夫从广州到了东京。初到日本,先要去区役所登记。在职务一档我不知如何是好,对方说:“在日本,结了婚身份就是主妇,如果还没有工作,就是‘专业主妇’。”我对这个新身份很不以为然,却也无可奈何。在从前的概念里,主妇是些没什么文化、每天煲汤煮饭的小市民,谁知到了日本的第一天,我就从高级经理变成了主妇,还是“专业”的。

关于公路工程投标编制方案的探讨

公路工程建设规模随社会经济的发展而逐步扩大,与此同时相继有更多的施工单位参与其中,在市场竞争日益激烈的背景下,施工单位需要高度重视工程投标方案的编制工作,形成具有核心竞争力的投标方案,由此提高中标的几率。在本文中,则围绕公路工程投标编制方案的相关工作要点展开探讨,以期给同仁提供参考。

乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素c氧化酶Ⅲ的特异性结合

目的探讨HBVX蛋白与细胞色素c氧化酶Ⅲ（COXⅢ）之间的结合作用。方法采用交合实验验证HBVX蛋白和COXⅢ在酵母细胞内的结合作用，利用离体结合实验证实两者在体外的结合作用，采用免疫共沉淀实验证实两者在哺乳动物细胞中的结合作用。结果携带CoXⅢ基因的酵母与携带X基因的酵母交合后发生反应，β-半乳糖苷酶（LacZ）活性检测菌落呈现蓝色，离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带，提示X蛋白和COXⅢ在体外存在直接相互作用，免疫共沉淀实验在相对分子质量为17000处出现蛋白条带，提示在哺乳动物细胞水平仍能检测到X蛋白和COXⅢ的特异结合。结论COXⅢ与X蛋白在原核细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合，HBV可能通过此反应干扰线粒体呼吸链功能及能量代谢过程。

乙型肝炎病毒前S1结合蛋白的筛选和鉴定

目的利用酵母双杂合体系筛选HBV前S1结合蛋白，进一步探讨前S1蛋白在HBV感染中的作用。方法PCR扩增HBV前S1基因序列，根据酵母双杂合体系构建饵质粒pAS2-1-preS1，并测定序列；饵质粒转化入酵母菌AH109，Western印迹法证实前S1-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2—1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞，通过选择性培养及β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落，分离实验排除假阳性克隆，扩增阳性克隆的目的基因并测定序列，查询其同源序列，行交合实验进一步证实目的蛋白同前S1蛋白在酵母细胞中能否特异性结合。结果成功构建pAS2-1-preS1饵质粒，Western印迹法证实转化饵质粒的酵母细胞能正确表达前S1-BD融合蛋白，pAS2—1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后，选择性培养出101个菌落，经β-半乳糖苷酶活性测定及分离实验后筛选出1个阳性克隆，其cDNA插入片段与丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节蛋白激酶（MAPK—ERK）激酶1（MEK1）基因高度同源。交合实验证实MEK1同前S1蛋白在酵母细胞中可特异性结合。结论酵母双杂合体系证实MEK1可能是一个前S1结合蛋白。

乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ结合的定位研究

目的探索细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ（COXⅢ）与乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的具体结合位点。方法构建pAS2-1-X变异体重组载体，醋酸锂转化法将其转入酵母细胞，通过PCR法及测序法证实目的片段转入酵母细胞；Westem blot法明确变异体蛋白在酵母细胞中能否正确表达，滤膜转印法排除自身激活作用；固体培养基交合实验及β-半乳糖苷酶活性实验检测HBx和COXⅢ的结合区域。结果成功构建含HBx第1～72位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-Xl和第1～117位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-X2，测序及PCR均证实片段的正确性。Western blot证实变异体蛋白在酵母细胞中可正确表达，且变异体蛋白无自身激活作用。交合实验及β-半乳糖苷酶活性检测将HBx和COXⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸。结论通过酵母双杂合实验证实HBx和COXⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸，此结合区域的明确有望帮助进一步阐明X蛋白在体内的作用机制，并可能为慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的防治提供新思路。