miR-214对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:通过构建miR-214的真核表达载体,研究其对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:以A549细胞基因组DNA为模板,扩增得到miR-214前体序列,插入表达载体pcDNA3.1(+)克隆获得pcDNA3.1(+)-miR-214。将真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-214转染到A549细胞中,并采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)对其表达情况进行验证。采用MTT和transwell小室等方法分别检测转染重组质粒pcDNA3.1(+)-miR-214对A549细胞增殖能力和侵袭能力的影响。结果:成功构建了miR-214稳定过表达的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-214;real-time PCR检测结果表明,转染pcDNA3.1(+)-miR-214后A549细胞中miR-214过表达(P<0.05)。miR-214过表达后A549细胞的增殖和侵袭能力均明显降低。结论:miR-214在A549细胞中过表达能够抑制细胞的增殖和侵袭能力,为进一步深入研究miR-214在肿瘤中的作用机制提供了实验依据。

Mir-181a通过靶向c-fos基因抑制肺癌细胞迁移

目的:利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-181a的直接靶基因c-fos,探讨miR-181a促进肺癌细胞迁移的可能机制。方法:Transwell小室检测miR-181a对肺癌细胞迁移的影响;应用生物信息学预测软件TargetScan对miR-181a靶基因进行预测,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-181a对靶基因c-fos的3'UTR区的调控作用;通过Westernblot方法检测miR-181a对c-fos蛋白表达的影响;结果:A549细胞转染miR-181a后,细胞的迁移能力降低;生物信息学预测c-fos是miR-181a的靶基因,构建融合c-fos的3'UTR区表达质粒pMIR-c-fos,在此基础上对c-fos的3'UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明miR-181a能够作用于c-fos的3'UTR。Western blot方法进一步证实c-fos是miR-181a的靶基因。结论:Mir-181a可能通过靶向c-fos基因,抑制肺癌细胞迁移。

miR-214表达载体构建及其对靶基因β-catenin的调控

目的:构建miR-214真核表达载体,验证miR-214对其靶基因β-catenin的调控作用。方法:以基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增包括miR-214前体的基因序列,将其插入表达载体pcDNA3.1(+)获得pcDNA3.1-miR-214真核表达载体。将其转染到A549细胞后,通过实时定量PCR(Real-time PCR)方法对其表达情况进行验证。应用生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对miR-214靶基因进行预测,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-214对靶基因β-catenin的3'UTR区的调控作用。通过Westernblot方法检测miR-214对β-catenin蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-214表达载体pCDNA3.1-miR-214。Real-timePCR结果表明pCDNA3.1-miR-214在A549细胞中能够过表达成熟的miR-214基因。生物信息学预测β-catenin是miR-214的靶基因,并构建融合β-catenin的3'UTR区表达质粒pMIR-β-catenin,在此基础上对β-catenin的3'UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明miR-214能够作用于β-catenin的3'UTR。Westernblot方法进一步证实β-catenin是miR-214的靶基因。结论:miR-214作用于β-catenin的3'UTR,可在转录后水平调控β-catenin的表达。