人乳头瘤病毒16型L1基因重组表达质粒的构建及在E.Coli宿主中的表达与鉴定

构建 pGEX4T 1 HPV16L1重组表达系统 ,为进一步研制基因工程疫苗奠定基础 ,采用PCR方法扩增HPV16中国分离株L1外源基因片段 ,pGEX4T 1为表达载体 ,构建pEGX4T 1 HPV16L1重组表达系统 ,在大肠杆菌宿主BL(2 1)中 ,经IPTG诱导 ,表达融合蛋白GST L1,经SDS PAGE电泳和Westernblot进行鉴定结果表明 ,成功构建pEGX4T 1 HPV16L1重组表达质粒并获得高效表达并经Westernblot鉴定为L1外源蛋白。提示 :所构建的 pGEX4T 1

大鼠心室肌M_3受体与间隙连接蛋白43作为抗心律失常药物靶点的综合研究

目的在蛋白质分子水平研究心律失常相关蛋白质M3受体与间隙连接蛋白43之间的结构相互作用,并为其作为筛选药物靶点提供依据.方法通过免疫组化结合激光共聚焦显微镜,及免疫沉淀与免疫印迹技术,研究M受体与间隙连接蛋白43的结构性共定位关系.结果证实了大鼠心室肌细胞膜蛋白中M1～M5等5个亚型的存在;观察到大鼠单个心肌细胞膜上M3受体与间隙连接蛋白43的结构性共定位;发现M受体各亚型与间隙连接蛋白43均存在结构整合,且一定浓度离子型去垢剂可破坏M3受体与间隙连接蛋白43的结构整合关系,并进一步发现参与M3受体结构整合的是间隙连接蛋白43的磷酸化形式.结论大鼠心室肌M受体亚型与间隙连接蛋白43的磷酸化形式存在结构性共定位关系,且可被一定浓度离子型去垢剂破坏.

M3受体激动剂对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的影响

目的研究M3受体激动剂胆碱对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的影响。方法应用全细胞膜片钳技术记录M3受体激动剂胆碱对豚鼠单个心室肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响;采用激光扫描共聚焦技术观察细胞内钙离子的变化。结果应用10 mmol.L-1胆碱使豚鼠心室肌细胞ICa-L密度从(9.02±0.82)pA/pF减少到(5.61±0.55)pA/pF(n=4,P<0.01),5 nmol.L-14-DAMP能够使其恢复至(8.12±0.65)pA/pF(n=4,P<0.01);10 mmol.L-1胆碱抑制KCl除极诱导的心肌细胞内钙的升高,从(2.76±0.05)降至(1.37±0.05)倍(n=8,P<0.01),5 nmol.L-14-DAMP可以阻断该作用(n=8,P<0.01)。结论M3受体激动剂胆碱通过延长L型钙通道激活过程而明显抑制ICa-L,减少细胞外的钙离子内流,降低心肌细胞内钙,从而发挥抗心律失常作用。

白藜芦醇能够修复离体缺血再灌注损伤大鼠心脏M_3受体与间隙连接蛋白43间结构及功能性整合

为了探讨白藜芦醇是否能通过影响M3受体和间隙连接蛋白43(Cx43)间结构及功能性整合发挥其抗心肌缺血再灌注损伤作用,应用免疫共沉淀、免疫印迹及免疫荧光技术研究白藜芦醇对M3受体与Cx43间结构及功能性整合的影响。结合大鼠离体II导联心电图及心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的检测观察白藜芦醇是否能恢复心肌缺血再灌注损伤。白藜芦醇能修复心肌缺血再灌注损伤所致的M3受体与Cx43间结构及功能性整合的破坏及纠正Cx43表达异常。同时QRS波时限?SOD及MDA的改变也得到相应恢复。白藜芦醇能修复M3受体与Cx43间结构及功能性整合而发挥抗缺血再灌注损伤作用。

大明胶囊对高脂血症大鼠心肌M受体各亚型mRNA表达的影响

目的通过检测M受体各亚型在心肌上的mRNA表达量,研究大明胶囊对高脂血症大鼠降血脂作用的分子机制。方法制备高脂血症大鼠模型,尾静脉取血测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游离脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等血脂指标;Trizol法提取心肌总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定M2、M3、M4、M54种M受体亚型mRNA的表达,观察其在高脂、正常和给药3种条件下的差异。结果高脂血症时血清中的TC、TG、LDL、FFA及MDA水平升高(P<0.05),HDL与SOD降低(P<0.05),经大明胶囊治疗后TC、TG、LDL、FFA及MDA水平降低(P<0.05),HDL与SOD水平上调(P<0.05)至近正常水平;比较高脂模型组与正常组M受体各亚型mRNA表达,结果M2、M4、M5受体亚型表达减弱,M3受体亚型表达增强,差别有统计学意义(P<0.05)。给大明胶囊后与高脂模型组比较M3受体亚型mRNA表达增强,M2受体亚型表达减弱,且具有显著差异(P<0.05),M4、M5受体亚型mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论高脂血症大鼠模型建立成功,大明胶囊具有降血脂作用,并且M3受体的水平上调是大明胶囊降血脂作用的分子机制之一。

人乳头瘤病毒11型L1基因原核表达系统的构建及鉴定

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1原核表达系统pBAD(B)鄄HPV11L1,表达HPVL1蛋白,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础。方法PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型L1基因片段,克隆至pBluescript质粒,并测序。将其从克隆重组质粒中切下连入表达载体,建立pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达重组质粒,在大肠杆菌宿主菌Top10中,经阿拉伯糖诱导,表达融合蛋白L1,经SDS鄄PAGE电泳和Westernblot进行鉴定。结果3株HPV11L1经测序发现变异一致,每株均有2个核苷酸变异,但未影响氨基酸变化。经SDS鄄PAGE鉴定L1蛋白相对分子质量为59×103,与预期值相同,Westernblot证明表达蛋白能与单克隆抗体反应,成功构建了pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达系统。结论所构建的pBAD(B)鄄HPV11L1原核表达系统能够高效表达HPV11L1蛋白。

优化心肌膜蛋白提取方法及心肌缺血时间隙连接蛋白43的表达变化(英文)

目的优化膜蛋白提取方法,以便研究心肌缺血时connexin43(间隙连接蛋白43)的表达变化。方法①差速离心法结合溶剂提取法提取心肌膜蛋白,溶解膜蛋白时比较了6组方案,通过各组方案在聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带分布差异筛选出最佳方案,分析心肌细胞膜表面受体表达。②通过左冠脉结扎造成对照组、5min、20min、60min心肌缺血组,研究缺血时心肌connexin43表达变化。结果①最终选择RIPA含4%SDS来溶解膜蛋白,并成功检测出connexin43,βactin(管家蛋白),M受体(毒蕈碱型乙酰碱受体)等膜蛋白。②免疫印迹技术检测缺血不同时相connexin43表达变化,5min、20min、60min缺血组相对对照组分别减少20%、60%、76%。结论应用此方案能成功提取心肌膜蛋白,为进一步研究心肌缺血时connexin43的表达变化奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的 :构建人乳头瘤病毒 16型与 11型 L 1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法 :采用 PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒 11型晚期基因 L 1,并对其进行克隆测序 ;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒 16型和 11型 L 1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中 ,分别位于强启动子 Ppolh和弱启动子 P10之下 ;利用酶切和 PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果 :PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒 11型的 L1基因 ,得到人乳头瘤病毒 16型 L1和 11型 L1基因双价重组杆状病毒转移质粒 ,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论 :本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒 ,为进一步构建双价 L 1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒 (HPV) 16型晚期基因 L1的原核表达质粒 ,以期从中选出能够高效表达 HPV16 L1的重组子 ,为进一步表达 L1蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略 ,将 HPV16 L1基因分别克隆到原核表达载体 p Trac99A和 p ET- 2 1c中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子 p Trc99A- HPV16 L1和 p ET- 2 1c-HPV16 L1。结论 HPV16

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1在大肠杆菌中的表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与宫颈癌的发生关系密切。其晚期蛋白Ｌ１是主要结构蛋白，可以刺激机体产生中和抗体，对病毒攻击可以起到保护作用。本研究将ＨＰＶ１６型中国分离株的Ｌ１基因定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２１ｃ质粒中，建立ＨＰＶ１６ Ｌ１在大肠杆菌中的高效表达系统ｐＥＴ２１ｃ－ＨＰＶ１６Ｌ１，该系统在ＩＰＴＧ的诱导下可表达 ６０ｋｕ的 Ｌ１蛋白，表达效率为 ２３％，此蛋白通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ得到证实。该表达体系的成功建立可以为进一步研究ＨＰＶ１６ Ｌ１蛋白的分子和免疫学特性以及基因疫苗的研制提供实验依据。

HIV感染过程及致病机理

AIDS是由HIV引起的传染性疾病。自1981年Michael S Gettlieb报道首倒AIDS以来，虽已有十几年的研究历程，然而人类仍处于AIDS的威胁之下，为寻求AIDS的有效防治，对于HIV的感染过程及致病机理还有待于深入探讨。

LAK细胞及活化胚胎胸腺细胞对脑胶质瘤细胞的体外作用

目的 探讨体外培养后人胚胎胸腺细胞 (ETC)表面抗原的转变及进行移植的时机 ,比较不同源LAK细胞、活化ETC联合与TJ90 5细胞的体外作用效果。方法 对不同处理的人胚胎胸腺悬液培养前后观察 ,测定细胞表面抗原 ;进行LAK细胞、活化ETC体外杀瘤活性比较。结果 应用特殊培养液培养 ,可以使人胚胎胸腺上皮细胞生存2 8天 ,分离后悬液比混悬液细胞表面抗原早期达稳定 (CD4/CD8=2 .2 6 ) ;胸腺LAK细胞对TJ90 5细胞的杀伤作用与脾LAK细胞无显著性差异。结论 活化ETC在体外对肿瘤细胞无抑制作用 ,不同源LAK细胞和活化ETC联合对TJ90

人乳头瘤病毒基因工程疫苗的基础实验研究

人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生、发展密切相关,故研制HPW16型基因工程疫苗对预防HPV感染、控制宫颈癌的发生有重要意义。本研究构建HPV16 L1基因工程菌并进行了基础实验研究。首先采用PCR技术从3例宫颈癌组织中扩增和克隆了HPV16L1基因片段并进行测序。进而构建了pPIC3.5～HPV16L1真核表达工程菌、pQE31～HPV16L1和pGEX4T-HPV16LI原核表达工程菌及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。经SDS-PAGE、Westem blot和电镜等手段证明了工程菌表达HPV16 L1蛋白的分子特性和免疫原性,而且,重组菌表达的HPV16 L1可以形成类病毒颗粒(VLP)。经免疫BALB/C小鼠可获得高效价特异血清,证实重组HPV16 L1蛋白具有良好的免疫原性。为进一步研制临床应用疫苗及血清学诊断试剂提供了实验基础。

同型半胱氨酸对豚鼠心房肌细胞钠电流作用的研究

目的研究同型半胱氨酸对豚鼠心房肌细胞钠通道的作用。方法应用Langendorff装置分离单个豚鼠心房肌细胞,运用全细胞膜片钳技术检测同型半胱氨酸对心肌离子通道的作用。结果同型半胱氨酸可以明显地增加豚鼠心房肌细胞上的钠电流,50μmol/L同型半胱氨酸可以增加钠电流47.1%,而500μmol/L同型半胱氨酸可增加钠电流115.7%,同型半胱氨酸对钠电流作用的半数有效浓度为(90.8±18.6)μmol/L,50μmol/L同型半胱氨酸可使钠通道的最大激活电位由-30mV升至-20mV;而通道动力学研究显示,同型半胱氨酸可以明显地延迟钠通道的失活和加快钠通道的复活。结论同型半胱氨酸可以明显地增加豚鼠心房肌细胞钠电流,改变钠通道的最大激活电位,其主要是通过抑制钠通道失活过程增加钠电流的幅度。

体外培养冻存的胎脑组织的实验性研究

４个月龌的人胎脑组织在无菌条件下分离，经酶消化，低温冷冻保存６个月，胎脑组织在３７℃水溶中快速复温并在体外培养，实验结果证实经冻存的人胎脑组织在体 外可以继续生长发育。因此我们得出结论，人胎脑组织可被冷冻保存且保持活性。

大鼠胎脑组织冻存与同种异体移植

目的 探讨冻存大鼠胎脑细胞体外培养的活性及其移植后的存活情况。方法 对经冷冻保存 1～ 2 4周的WK大鼠胎脑细胞进行体外培养 ,观察其存活情况 ,并将保存 2 4h后培养 14d的胎脑细胞行脑内定位移植。结果 冻存 1～ 2 4周的胎脑组织其活细胞率在 90 %以上 ,复苏后培养 14d的胎脑细胞活性最强 ;胎脑细胞移植后可在受者体内存活至少 30d以上。结论 冷冻保存后培养的胎脑细胞能够存活 。

HIV-1包膜V3区在病毒侵入靶细胞中的增强作用

目的 明确Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirustype 1,HIV 1)包膜糖蛋白gp12 0第三可变区 (variableregion ,V3)在病毒进入靶细胞的早期阶段中的作用。方法 合成了 3个环状V3多肽 ,包括V3 BH10、V3 ADA和V3 89.6以及直链和短链多肽V3 BH10 /CA、V3 NNT2 4和V3 IRI12。构建了 3株分别带HIVHXB2株、ADA株和 89.6株包膜的伪病毒并观察了多肽对不同嗜性HIV侵入靶细胞能力的影响。结果 (1)HIV 1V3区多肽以毒株特异性模式增强HXB2、ADA和 89.6进入靶细胞 ;(2 )直链V3多肽与其环状多肽具有相似作用 ;带有C末端的短肽V3 NNT2 4也有与长链V3 BH10 /CA相近的作用 ,只有中央保守区的短链V3 IRI12没有类似功能。结论 本研究首次发现HIV 1V3区在病毒进入靶细胞早期阶段中具有毒株特异性增强病毒侵入的作用。该发现有助于进一步明确HIV