吉非替尼联合二甲双胍对EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

目的探讨吉非替尼联合二甲双胍对肺癌H1975细胞的抑制增效作用及其机制。方法采用MTT、克隆形成实验观察吉非替尼与二甲双胍单用及联用对原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞增殖活性的影响;Matrigel包被的Transwell小室检测细胞侵袭能力;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot、免疫荧光法检测凋亡和上皮细胞-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的变化。结果吉非替尼联合二甲双胍组对H1975细胞增殖、侵袭及迁移抑制效应优于吉非替尼组,协同增效作用明显(P<0.05);吉非替尼和二甲双胍单用时较对照组的细胞凋亡率增加,当两者联合作用时细胞凋亡率增加更显著(P<0.05),且明显下调抗凋亡相关蛋白(Bcl-xl、Mcl-1)和上调促凋亡蛋白Bax;两药联用明显逆转H1975细胞EMT的发生;间质细胞相关蛋白(Vimentin、N-cadherin、Slug、Snail)表达水平降低,上皮细胞相关蛋白E-cadherin表达水平升高。结论吉非替尼联合二甲双胍可显著抑制EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的增殖、侵袭和迁移,促使肿瘤细胞凋亡;其机制可能通过激活线粒体凋亡途径及逆转EMT的发生来发挥抗肿瘤作用。

IL-6诱导非小细胞肺癌Gefitinib耐药的作用和机制

目的明确IL-6诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)药物吉非替尼(Gefitinib)发生耐药的作用,探讨其可能机制。方法使用噻唑蓝(MTT)、划痕实验、蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测IL-6处理肺腺癌细胞株PC-9后其对Gefitinib的敏感性、细胞迁移能力、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达等的变化;构建IL-6高表达细胞株PC-9psb388,检测其与PC-9相比在对Gefitinib的敏感性、细胞迁移能力、p-mTOR蛋白表达等方面的变化;使用雷帕霉素联合IL-6处理PC-9、IL-6单独处理PC-9以及雷帕霉素单独处理PC-9psb388,MTT检测3组细胞Gefitinib敏感性的变化;使用PC-9、PC-9psb388细胞构建裸鼠移植瘤模型,对比两组移植瘤大小并用免疫组织化学检测p-mTOR蛋白和IL-6的表达。结果 IL-6处理PC-9组较未处理组对Gefitinib的敏感性显著降低,细胞迁移能力增强,p-mTOR蛋白表达增高。PC-9psb388对Gefitinib的敏感性与PC-9相比明显降低,细胞迁移能力增强并且p-mTOR蛋白活化增高。雷帕霉素联合IL-6处理PC-9组对Gefitinib的敏感性较IL-6单独处理PC-9组升高,p-mTOR蛋白表达降低。同样雷帕霉素处理PC-9psb388组对Gefitinib的敏感性较未处理组增高,且p-mTOR蛋白活化降低。在动物实验中,PC-9psb388组裸鼠移植瘤体积明显大于PC-9组,检测移植瘤组织中IL-6和p-mTOR蛋白的表达发现,PC-9psb388组显著高于PC-9组。结论 IL-6可能通过活化p-mTOR蛋白诱导非小细胞肺癌发生EGFR-TKI耐药。

海芋粗提物对人肝癌细胞的细胞毒和凋亡诱导作用

目的:探讨海芋粗提物对人肝癌细胞的细胞毒和凋亡诱导作用及其作用机制。方法:用海芋粗提物处理人正常肝细胞(ID2)及肝癌细胞(SMMC-7721),用细胞增殖试验(MTT法)、克隆形成试验、EdU掺入试验研究海芋粗提物对人正常肝细胞和肝癌细胞的增殖抑制作用;吖啶橙/溴乙啶(A0/EB)染色检测细胞凋亡;流式细胞术检测海芋粗提物对细胞周期的影响;RT-PcR检测细胞周期及凋亡相关基因PPARγ、cyclin D1、Rb、P21、Bax、Bcl-2基因mRNA表达。结果:用不同浓度海芋粗提物处理后,肿瘤细胞增殖活性降低(P<0.05),呈时间-剂量-效应关系;克隆形成下降(P<0.05);EdU标记指数降低(P<0.05);AO/EB染色凋亡细胞增多(P<0.01);细胞周期分布改变,凋亡指数显著增加(P<0.01),G_0/G_1期细胞增加(P<0.05),S期和G_2/M期细胞减少(P<0.05);RT-PCR结果显示,海芋粗提物(400μg/ml)处理后,PPARγ表达增加46.0%(P<0.01)、Cyclin D1降低43.7%(P<0.01)、Rb增加283.3%(P<0.01)、Bax增加77.1%(P<0.01)、Bcl-2降低24.8%(P<0.05)。结论:海芋粗提物对肝癌细胞具有细胞毒和诱导凋亡作用,其作用机理可能与激活PPARγ,上调Rb、Bax基因表达,下调Cyclin D1、Bcl-2基因表达有关。

不同剂量吉非替尼对博莱霉素所致大鼠肺纤维化影响的比较

目的对比观察不同剂量吉非替尼对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的影响。方法将75只雄性SD大鼠分为5组:对照组、博莱霉素组、低剂量吉非替尼联用组、中剂量吉非替尼联用组、高剂量吉非替尼联用组,每组15只。观察大鼠存活情况,第21天时杀鼠取左肺石蜡切片行HE染色及Masson染色,右肺ELISA方法检测羟脯氨酸含量。结果高剂量吉非替尼联用组能明显加重博莱霉素所致肺纤维化,Ashcroft评分、肺组织胶原沉积及羟脯氨酸含量明显增多(P<0.05)。中等剂量吉非替尼联用组Ashcroft评分较博莱霉素组差异无统计学意义(P>0.05),羟脯氨酸含量明显增加(P<0.05)。而低剂量吉非替尼联用组各项指标与博莱霉素组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论吉非替尼能加重博莱霉素所致大鼠肺纤维化,且吉非替尼剂量越大,大鼠肺纤维化程度越高。

根据转录组学分析奥希替尼获得性耐药机制的研究

目的根据转录组测序技术分析介导肺癌奥希替尼耐药的信号通路,发现潜在干预靶点。方法体外构建肺癌奥希替尼一线/二线治疗模式下配对的敏感/耐药细胞株,采用高通量测序技术检测耐药前后细胞转录本表达量并使用R-package CORNAS筛选差异表达基因,借助Venny在线工具分析两组配对细胞株差异表达基因的交集,运用DAVID Bioinformatics Resources数据库分别对两种耐药模式下共有差异基因和特有差异基因进行京都基因与基因组百科全书(kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路和基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。采用STRING 12.0数据库分析关键通路富集基因相互作用关系及靶点分子,借助chiplot在线工具绘制分子相互作用网络图。结果两组配对细胞株共有差异表达基因显著富集在Cell Cycle通路,一线治疗耐药特有差异基因富集在Cell Cycle和Ribosome biogenesis in eukaryotes通路,二线治疗耐药特有差异基因富集在MAPK signaling通路;GO富集分析发现共有差异表达基因参与cell division,分子功能是ATP binding,一、二线治疗耐药特有差异表达基因分别参与了rRNA processing和inflammatory response生物过程,主要分子功能分别是RNA binding和Protein binding;共筛选出5种关键靶点分子,包括CCNB1(共有)、CDC25A和NOP56(一线耐药特有)、JUN和MYC(二线耐药特有)。结论奥希替尼一线或二线治疗模式下共同及特有的潜在获得性耐药机制,为克服奥希替尼耐药提供潜在的治疗靶点。

水飞蓟宾增敏克唑替尼抑制间变性淋巴瘤激酶阳性非小细胞肺癌的作用及机制

目的研究水飞蓟宾联合克唑替尼对间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因阳性非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖抑制作用和机制。方法采用单加水飞蓟宾、单加克唑替尼或两药联合作用于NSCLC细胞株H2228和H3122，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞的增殖活性，以划痕实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力，以免疫荧光实验检测细胞上皮间质转化（EMT）标志蛋白E-Cadherin和Vimentin的表达情况，以Westernblot法检测细胞中ALK、P-ALK、E-Cadherin和Vimentin蛋白的表达变化。将H2228细胞悬液注射入裸鼠皮下，构建裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤的生长情况。结果MTr法检测结果显示，当水飞蓟宾浓度为100μmol／L时，H2228和H3122细胞的存活率分别为（88．38±4．10）％和（72．27±3．62）％，对细胞的增殖活性影响较小。当100μmol／L的水飞蓟宾与克唑替尼联合使用时，克唑替尼对H2228细胞的I50从（917．10±7．75）nmoL／L下降到（238．73±7．67）nmol／L，对H3122细胞的I50从（472．50＋15．70）nmol／L下降到（206．10±12．01）nmol／L，联合用药后克唑替尼对H2228和H3122细胞的I50明显降低。与对照组H2228细胞比较，100μmol／L水飞蓟宾组、400nmol／L克唑替尼组、100μmol／L水飞蓟宾联合400nmoL／L克唑替尼组H2228细胞的克隆形成率分别为（83．34±2．72）％、（69．42±3．06）％和（27．32±1．42）％；与对照组H3122细胞比较，100μmoL／L水飞蓟宾组、400nmol／L克唑替尼组、100μmol／L水飞蓟宾联合400nmol／L克唑替尼组H2228细胞的克隆形成率分别为（84．45±5．67）％、（45．02±5．83）％和（17．43±3．83）％。水飞蓟宾联合克唑替尼后，H2228和H3122细胞的克隆形成能力均明显下降（均P〈0．01）。迁移和侵袭实验结果显示．水飞蓟宾与克唑替尼联用能明显抑制H2228细胞的迁移和侵袭（均P〈O．01）。Westernblot法检测结果显示，无论单用水飞蓟宾、还是联合克唑替尼，H2228细胞中E-Cadherin蛋白的表达明显升高，p-ALK、Vimentin蛋白表达明显下降，ALK总蛋白的表达无明显变化。单用克唑替尼组和联合用药组的肿瘤重量分别为（9．40±2．58）g和（4．58±1．07）g，联合用药组的抑瘤效果明显好于克唑替尼单药组（P〈0．05）。结论水飞蓟宾可增强克唑替尼对ALK阳性NSCLC细胞的增殖抑制作用，其机制可能与两药联用能进一步降低ALK阳性NSCLC细胞的ALK活性，促进间质上皮转化（MET）的发生有关。

HDAC3影响二甲双胍抑制非小细胞肺癌增殖的实验研究

目的:探讨二甲双胍对非小细胞肺癌增殖的影响,并阐明HDAC3在其中的作用。方法:在体外用不同浓度的二甲双胍对人非小细胞肺癌细胞系(H460细胞、H1299细胞及A549细胞)进行处理,通过CCK-8以及Ki-67检测其对细胞增殖的影响。建立肺癌细胞(H1299细胞与A549细胞)移植瘤模型检测二甲双胍在体内的抗肿瘤效应。慢病毒介导H1299细胞过表达HDAC3,结合蛋白质组学分析探究HDAC3过表达影响二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的效应和潜在机制。结果:体外实验表明,二甲双胍呈剂量依赖性抑制多种非小细胞肺癌细胞系的存活率和增殖率。体内实验证实,二甲双胍能显著降低移植瘤的体积与重量,同时对小鼠体重无明显影响。而且,二甲双胍可抑制肺癌细胞中HDAC3的表达,而HDAC3过表达则显著降低了二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的效应。蛋白质组学分析提示,H1299细胞过表达HDAC3后经二甲双胍处理所筛选的差异蛋白主要富集到HIF-1通路以及糖代谢相关通路。结论:二甲双胍在体外、体内均具有抗肿瘤效应,过表达HDAC3会抑制该效应,靶向HDAC3可能成为联合二甲双胍治疗非小细胞肺癌的新策略。

2-脱氧葡萄糖逆转非小细胞肺癌细胞对奥希替尼继发性耐药的作用及机制

目的探究2-脱氧葡萄糖(2-DG)逆转非小细胞肺癌细胞对奥希替尼继发性耐药的作用及机制。方法将非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975(购自美国国家细胞库)通过体外诱导法处理后建立奥希替尼继发性耐药肺癌细胞株H1975-OR,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法、克隆形成实验、Ki67蛋白荧光染色、凋亡通路相关蛋白表达水平检测,评估细胞株H1975-OR对奥希替尼的耐药性;通过测定细胞株H1975和H1975-OR培养基上清液中乳酸含量确定细胞糖酵解水平;Western blot法检测糖酵解关键酶(己糖激酶2、葡萄糖转运子1、磷酸化丙酮酸激酶M2亚型)及凋亡相关蛋白(B淋巴细胞瘤-2、Bcl-2蛋白相互作用的细胞死亡调解子)的表达;分为空白对照、2-脱氧葡萄糖(4 mmol/L)单药处理、奥希替尼(3μmol/L)单药处理、2-脱氧葡萄糖(4 mmol/L)+奥希替尼(3μmol/L)联合处理组,用流式细胞分析仪检测药物处理后的细胞凋亡率,评估药物的促凋亡能力。采用SPSS 16.0统计软件,用独立t检验对结果进行统计分析。结果奥希替尼敏感细胞株H1975比奥希替尼继发性耐药细胞株H1975-OR的糖酵解水平低[乳酸产生量分别为(21.0±0.9)和(26.5±2.8)mmol/(L×10^4cells),P<0.05];细胞株H1975-OR经4 mmol/L的2-脱氧葡萄糖处理后可逆转其对奥希替尼的继发性耐药,对奥希替尼的IC50值由(7.0±1.9)μmol/L降至(1.4±0.1)μmol/L,接近敏感细胞株H1975对奥希替尼的IC50值(1.0±0.2)μmol/L;细胞株H1975-OR经2-脱氧葡萄糖+奥希替尼联合处理后细胞凋亡率为(26.7±2.4)%,显著高于对照组的(5.1±0.7)%、2-脱氧葡萄糖单药处理组的(6.1±2.5)%和奥希替尼单药处理组的(11.4±2.7)%(均P<0.05);细胞株H1975-OR经2-脱氧葡萄糖+奥希替尼联合处理后,BIM蛋白表达为(177.8±28.1)%,显著高于对照组的(100.0±0)%(P<0.05);Bcl-2蛋白表达为(24.6±5.2)%,显著低于对照组的(100±0)%(P<0.05)。结论2-脱氧葡萄糖可以逆转NSCLC细胞对奥希替尼继发性耐药,其机制可能与抑制细胞糖酵解进而诱导凋亡增加有关。