膜联蛋白5对雄性SD大鼠睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响

目的研究注射膜联蛋白5后雄性SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β-羟类固醇脱氢酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达的改变,初步探讨膜联蛋白5影响睾酮分泌的机制。方法将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又分为7.5μg/kg组、15μg/kg组和30μg/kg组,每组5只。对照组大鼠腹腔注射等量的pH8.0 Tris-HCl,实验组腹腔注射不同剂量的膜联蛋白5,1次/d,连续20 d。用RT-PCR方法分别检测对照组和各实验组SD大鼠睾丸组织中睾酮合成相关的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达变化,并用Western blot方法检测以上3种物质蛋白质水平的变化。结果与对照组相比,在mRNA水平上,7.5μg/kg组和15μg/kg组大鼠睾丸组织P450 scc mRNA表达分别增加了25.9%[(0.68±0.04)vs(0.54±0.03),P<0.01]和27.8%[(0.69±0.04)vs(0.54±0.03),P<0.01];3β-HSD mRNA表达分别升高了32.9%[(1.05±0.07)vs(0.79±0.10),P<0.01]和53.2%[(1.21±0.07)vs(0.79±0.10),P<0.01];而30μg/kg组表达差异无统计学意义;在蛋白水平上,15μg/kg组大鼠睾丸组织P450 scc蛋白表达提高了34.2%[(0.37±0.04)vs(0.28±0.02),P<0.01],7.5μg/kg组和15μg/kg组的3β-HSD表达也分别增加了14.7%[(1.53±0.10)vs(1.34±0.05),P<0.01]和24.4%[(1.67±0.14)vs(1.34±0.05),P<0.01];而StAR的表达无论在转录水平还是在蛋白水平上,较对照组差异均无统计学意义。结论膜联蛋白5可通过调节P450scc与3β-HSD的表达来调节睾酮合成。

Annexin 5对雄性SD大鼠应激损伤的保护作用

目的研究膜联蛋白5(annexin 5,A5)对坐骨神经选择性损伤引起的慢性疼痛应激致雄性SD大鼠生殖损伤的保护作用。方法 32只雄性SD大鼠随机分为4组,分别建立对照组、假手术组、手术组和手术+A5组模型。手术+A5组于术后第2天腹腔注射15μg/kg剂量的A5,其他实验组腹腔注射等量的pH 8.0 Tris-HCl,每日1次,连续21 d。分别测各组SD大鼠体重、称重睾丸和附睾,计算其脏器系数,并对附睾尾进行精子计数。HE染色观察睾丸组织结构变化。用化学发光法检测各组大鼠血清中睾酮浓度。结果手术组大鼠与对照组相比,睾丸系数、附睾系数以及精子相对计数均降低(P<0.05);睾酮水平下降显著[(5.10±2.61)vs(22.40±4.30)mmol/L,P<0.01)];病理切片见睾丸生精细胞与腔内精子数量明显减少。假手术组大鼠与对照组比,上述指标均无统计学差异。手术+A5组与手术组比,精子相对计数与睾酮含量[(19.67±2.02)vs(5.10±2.61)mmol/L,P<0.01]均显著提高,其他参数均有不同程度的恢复,睾丸生精细胞与腔内精子数量减少程度显著恢复。结论 A5对慢性疼痛应激引起的生殖损伤具有一定的保护作用。

Annexin 5对人精子线粒体功能的影响

目的观察膜联蛋白5(annexin5)对人精子线粒体功能的影响。方法收集38例少弱精症患者精液标本。精子与an-nexin5共温育,用罗丹明(Rh123)和碘化吡啶(PI)染色并用流式细胞术检测人精子线粒体功能。结果添加annexin5组与对照组相比,线粒体功能良好的活精子百分率[(38.77±9.20)%vs(26.12±10.09)%,P<0.05]和线粒体荧光值[(509.72±45.02)vs(452.88±39.39),P<0.05]均有显著性升高。结论体外添加annexin5能增强精子线粒体的活性。

膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-羟基类固醇脱氢酶表达的影响

目的先前研究发现促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)刺激Leydig细胞后,膜联蛋白5(annexin 5)及睾酮水平同时增加,推测annexin 5和睾酮之间可能存在某种内在的联系,3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)是间质细胞的标记酶。文中旨在研究annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-HSD表达的影响。方法原代培养大鼠睾丸间质细胞,用不同浓度的annexin 5(0、10-10、10-9、10-8mol/L)处理间质细胞24h和用10-9mol/L的annexin 5处理细胞不同时间(6、12、24、36h),收集培养液,用化学发光法测定培养液中的睾酮含量;Western blotting方法分析睾丸间质细胞中3β-HSD的表达变化。结果不同浓度的annexin 5处理间质细胞24h后,与对照组比较,终浓度为10-10mol/L和10-9mol/L时,睾酮水平分别升高了18%[(14.38±0.30)nmol/Lvs(12.12±0.74)nmol/L](P<0.01)和26%[(15.25±0.47)nmol/Lvs(12.12±0.74)nmol/L](P<0.01);浓度为10-8mol/L时,睾酮水平虽也有升高趋势,但无显著性差异;而Western blotting结果显示,浓度为10-9mol/L时,3β-HSD表达量升高了63%(2.19±1.00vs1.34±0.19,P<0.05),浓度为10-10mol/L和10-8mol/L时,3β-HSD表达量无显著性差异;睾酮分泌与3β-HSD的表达呈显著正相关(r=0.430,P<0.05)。10-9mol/L的an-nexin5处理细胞不同时间,与对照组相比,6h和12h后睾酮的分泌虽有升高,但无统计学意义(P>0.05);24h后睾酮的分泌量显著升高了18%[(12.59±0.41)nmol/Lvs(10.70±0.09)nmol/L](P<0.01);而处理36h后,睾酮分泌量下降了21%[(14.44±1.65)nmol/Lvs(17.46±0.31)nmol/L](P<0.01)。结论在大鼠睾丸间质细胞中,annexin 5对睾酮分泌具有调节功能且呈剂量和时间依赖性;3β-HSD是该调节过程中的关键酶之一。

大鼠膜联蛋白5的重组表达及其对人精子体外运动功能的影响

目的:先前研究发现促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂对大鼠睾丸间质细胞中膜联蛋白5(annex-in5)的翻译和转录水平都有一定的影响,推测annexin5可能是睾酮分泌调节中的一个信号分子。为研究annexin5在雄性生殖调节中的作用,本研究拟获得具有活性的大鼠annexin5重组蛋白,并观察其对人精子运动功能的影响。方法:化学合成法合成大鼠annexin5的编码基因序列,将该基因插入组氨酸标签(HIS)融合表达载体pET28a中,在T7启动子控制下,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达HIS融合蛋白;以亲和层析法纯化表达融合蛋白并用活化部分凝血激酶时间(APTT)交叉试验法验证该蛋白的抗凝血活性。15例供精者的精液标本一式2份,1份加重组蛋白annexin5(终浓度为10-8mol/L),1份做对照,分别处理20和60min,用计算机辅助精液分析系统(CASA)分析精子活力、活动率;处理20min后,做精子爬高试验。结果:合成的目的基因产物长度为974bp,插入序列与annexin5的序列完全一致。在IPTG诱导下,BL21(DE3)重组菌高效表达出相对分子质量为36000的融合蛋白,经纯化获得95%纯度的融合蛋白,纯化蛋白具有很强的抗凝血活性。Annexin5处理20min后精子活动率提高了21%(P<0.05),活力提高了40%(P<0.01),而处理60min后精子活力、活动率与对照组比较均无显著性差异;精子爬高高度与对照组比较具有极显著差异[(37.84±6.35)mmvs(49.5±12.27)mm,P<0.01]。结论:成功构建了大鼠annexin5重组表达载体并在大肠埃希菌中高效表达annexin5蛋白,且该蛋白体外处理精子20min时提高精子的运动能力。

Annexin5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中StarD7表达的影响

目的先前研究发现annexin 5刺激大鼠睾丸间质细胞后,3β-羟类固醇脱氢酶(3βbeta-hydroxysteroid dehydro-genase,3β-HSD)及睾酮水平都增加,推测annexin 5和睾酮之间可能存在某种内在联系。文中旨在研究annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中的StarD7(START domain containing 7)表达的影响,探讨annexin 5影响睾酮分泌的机制。方法原代培养大鼠睾丸间质细胞,1nmol/L的annexin 5处理间质细胞24h,分别提取细胞总mRNA和总蛋白。RT-PCR检测StarD7的mRNA表达改变。Western blotting方法分析睾丸间质细胞中StarD7的蛋白表达变化。收取细胞爬片,利用免疫细胞化学的方法对StarD7在睾丸间质细胞中进行定位。结果与对照组相比,在mRNA水平上,加药组StarD7 mRNA的表达增加了44.5%(1.10±0.02 vs 1.59±0.09,P<0.05)。在蛋白水平上,加药组StarD7蛋白的表达增加了44.3%(1.49±0.10 vs 2.15±0.16,P<0.05)。StarD7主要定位在大鼠睾丸间质细胞的胞浆内,加药组的染色强度明显强于对照组。结论 StarD7在基因和蛋白水平均受annexin 5的调控,结合先前发现annexin 5可调控睾丸间质细胞睾酮合成的结果,提示annexin 5调控睾酮合成可能是通过调控StarD7的表达来实现的。

GnRH类似物对大鼠睾丸间质细胞MAPK的影响

目的:研究大鼠睾丸间质细胞中GnRH激动剂(GnRHa)和拮抗剂(GnRHant)对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的影响。方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞24h后,血清饥饿2h。GnRHa(10-7mol/L)或Gn-RHant(10-6mol/L)处理大鼠睾丸间质细胞不同时间(0、5、15、30、60、90min)后,Western印迹检测磷酸化ERK(p-ERK)和磷酸化p38(p-p38)蛋白水平以0min组为对照。此外,不同终浓度(1、5、10、20μmol/L)的PKC抑制剂GF109203X和GnRHa或GnRHant共同作用后,Western印迹检测p-ERK蛋白水平。结果:GnRHa或GnRHant刺激间质细胞不同时间后,p-p38蛋白水平与对照组比较均无显著性差异(P>0.05);加入不同终浓度的PKC抑制剂GF109203X处理细胞20min后,再用GnRHa刺激细胞10min,发现GF109203X在终浓度为10μmol/L和20μmol/L时p-ERK水平显著下降(P<0.05)。GnRHant刺激间质细胞后,p-ERK水平在15min时升高了约65%(P<0.05);30min时升高了约81%,达到最高水平(P<0.05);60min时开始下降,90min时恢复到基础水平。不同浓度GF109203X处理细胞20min后,再用GnRHant刺激细胞30min,p-ERK水平与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。结论:GnRHa可能通过PKC途径来诱导ERKMAPK信号通路的活化,而GnRHant对ERKMAPK信号通路的激活作用并非通过PKC途径来实现的;p38可能不参与间质细胞中GnRH类似物作用的MAPK分子信号通路。

膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞中类固醇急性调节蛋白和睾酮合成相关酶表达的影响

目的:研究膜联蛋白5(annexin 5)对大鼠睾丸间质细胞(Leydig细胞)睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响。方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞24 h后,用10-9mol/L的annexin 5处理间质细胞12 h和24 h,分别提取细胞总RNA和总蛋白;反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测类固醇急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、17α-羟化酶(17α-hydroxylase,CYP17A)、17β-羟基类固醇脱氢酶Ⅹ型(17β-HSD10)mRNA表达的改变,并用蛋白免疫印迹方法(Western blotting)检测蛋白表达水平的变化。结果:与对照组相比,在mRNA水平上,annexin 5处理细胞12 h后,只有17β-HSD10的表达升高了26%(P<0.05),其他差异均无统计学意义,而处理24 h后,StAR、P450scc和3β-HSD的表达分别升高55%、69%和59%(P<0.05),17β-HSD10升高了104%(P<0.01),17α-hydroxylase表达则无显著差异;在蛋白水平上,annexin 5处理细胞12 h后,17β-HSD的表达升高了39%(P<0.05),而处理24 h后发现,除StAR表达无显著变化外,P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达分别升高了35%、88%(P<0.05)和47%(P<0.01)。结论:Annexin 5对睾酮合成具有调节作用,这种作用是通过在基因水平和蛋白水平上影响P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达而实现的。

Annexin 5刺激大鼠睾丸Leydig细胞后的差异表达蛋白的研究

目的:研究annexin 5作用于大鼠睾丸Leydig细胞后的差异表达蛋白。方法:原代培养大鼠睾丸Leydig细胞,1 nmol/L的annexin 5处理Leydig细胞24 h,提取细胞蛋白用二维电泳分离蛋白并进行比较。选择与对照组有明显差异表达的蛋白点,进行质谱分析。结果:获得了分辨率和重复性均很好的差异蛋白图谱。筛选出的显著差异表达的50个蛋白点,共有36个蛋白点被成功鉴定,其中annexin 5处理组中高表达的为23个,低表达的为13个。结论:初步建立了annexin 5作用于大鼠睾丸Leydig细胞后的差异蛋白谱,筛选并鉴定出的这些蛋白质可能是影响睾丸Leydig细胞合成睾酮过程中的关键蛋白,研究结果为阐明annexin 5调控大鼠睾丸Leydig细胞分泌睾酮的具体机制奠定了基础。

人精子CatSper1 mRNA表达与精子活力的相关性研究

目的研究不同精子活力的人精子中精子特异性阳离子通道蛋白1(CatSper1)mRNA的表达差异,以及其与精子活力相关指标的相关性。方法分别收集少、弱精症患者精液标本和健康人对照精液标本各25份,用Trizol试剂提取精子中的总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CatSper1 mRNA表达改变。结果少、弱精症组CatSper1 mRNA表达水平与健康人对照组相比,差异具有统计学意义[(0.54±0.01)vs(1.13±0.05),P<0.01]。CatSper1 mRNA表达与精子活率以及a+b级精子百分率之间呈显著正相关。结论人精子CatSper1 mRNA表达与人精子活力呈正相关。

光照应激对SD大鼠小肠中annexin 5表达的影响

目的观察光照应激状态下SD大鼠小肠黏膜组织中annexin 5的分布和表达变化。方法建立SD大鼠光照应激模型,24 h持续光照,分为短期光照应激(2、3、4、7 d)和长期光照应激(14、21、28 d),分别取应激组和相应对照组的大鼠小肠组织,采用免疫组织化学和western blot技术分析annexin 5在各时间段大鼠小肠组织中的分布和表达。结果western blot结果显示,与对照组相比,持续光照2、3、4、7 d,实验组大鼠小肠中annexin 5表达无明显变化;持续光照14 d和21 d,实验组大鼠小肠中annexin 5的表达量显著高于对照大鼠,具有统计学意义(P<0.05);持续光照28 d,实验组大鼠小肠中annexin 5表达量虽仍高于对照鼠,但无显著性差异(P>0.05)。免疫组织化学显示,annexin 5在大鼠小肠中的分布未见明显改变,但光照应激后期实验组(14、21、28 d)annexin 5免疫组化显色较深。结论在光照应激后期(14、21 d)annexin 5的表达量明显增加。随着应激时间的延长(28 d),机体内代偿机制的建立,实验组annexin 5逐渐恢复至正常水平。说明大鼠小肠中annexin 5参与了应激过程。

膜联蛋白5对人精子膜及DNA完整性的影响

目的:研究膜联蛋白5(Annexin5)对人精子细胞膜及DNA完整性的影响。方法:①精子膜完整性测定:按精子浓度>20×106/ml;活率>60%选取标准收集精液标本53份,分为3组,实验组为47.5μl精液中加入2.5μl10-6mol/L的Annexin5;阴性对照组为47.5μl精液标本中加入2.5μl1mol/L的Tris-HCl(pH8.0,25℃);空白对照组为47.5μl精液标本中加入2.5μl0.01mol/L的PBS(pH7.4),作用20min后,通过精子低渗肿胀试验(HOS)检测精子膜的完整性。②DNA完整性测定:同方法①,3组实验标本作用20min后,每份标本加入2.5μl0.02mol/L的H2O2,作用60min,通过吖啶橙(AO)荧光染色检测精子核DNA的完整性。结果:An-nexin5处理20min后低渗肿胀精子百分率与空白对照组及阴性对照组比较均具有极显著差异[(66.17±12.02)%vs(58.13±13.08)%,P<0.01;(66.17±12.02)%vs(59.94±11.91)%,P<0.01];空白对照组与阴性对照组比较无显著性差异。加入H2O2后,Annexin5组的DNA碎片指数与空白对照组及阴性对照组比较均具有极显著差异[(6.39±1.07)%vs(11.16±1.16)%,P<0.01;(6.39±1.07)%vs(10.86±1.05)%,P<0.01],空白对照组与阴性对照组比较无显著性差异。结论:Annexin5蛋白能在体外提高低渗肿胀精子百分率,对精子膜的完整性具有保护作用,同时对HO作用引起的精子核DNA破坏起保护作用。

大鼠睾丸间质细胞中NO供体调控睾酮分泌的机制

目的研究一氧化氮(NO)供体(硝普钠,SNP)对大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响及其机制。方法大鼠睾丸间质细胞原代培养12 h后,用不同浓度的SNP(0,10-8,10-6,10-4mol/L)分别处理4、8、12 h,用化学发光法检测细胞上清睾酮(T)水平的变化;western blot法分析间质细胞内3β-HSD(3β-羟基类固醇脱氢酶)和annexin 5(膜联蛋白5)的变化。结果10-4mol/L的SNP处理间质细胞8 h后,睾酮水平较对照组上升23%(P<0.05);10-6mol/L的SNP处理12 h后,睾酮水平较对照组上升28%(P<0.05),10-4mol/L的SNP处理12 h,较对照组升高37%(P<0.05)。western blot结果显示,SNP的刺激对3β-HSD表达无显著影响。不同浓度SNP刺激间质细胞4 h和8 h后,annexin 5表达量与对照组比较无显著差异(P>0.05);10-6mol/L的SNP刺激12 h后,annexin 5表达量达到最高水平,较对照组升高55%(P<0.05);10-4mol/L的SNP处理12 h,annexin 5表达量较对照组升高48%(P<0.05)。结论SNP在低浓度范围内促进大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮,且睾酮的分泌对SNP具有时间和剂量的依赖性;SNP刺激睾酮分泌的过程并非通过3β-HSD介导,但可能与annexin 5表达有关。

ERK MAPK是annexin 5调节大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的重要途径

目的研究膜联蛋白5(annexin 5)调控大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮是否经由胞外信号调节激酶(ERK)促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。方法培养的大鼠睾丸间质细胞用无血清培养基培养2 h后,用1 nmol/L annexin 5处理0、5、10、30、60、90 min,western blotting检测磷酸化ERK(P-ERK)、总ERK(T-ERK)的蛋白质表达水平;分别用pH 8.0的Tris-HCl、ERK抑制剂PD98059(50μmol/L)、annexin 5和annexin 5+PD98059作用于培养细胞,分析并比较培养细胞3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)蛋白质表达水平及上清液中睾酮含量。结果 annexin 5刺激间质细胞5 min后P-ERK水平开始升高(P<0.05),在10 min时达到峰值,比对照组升高了33%[(0.89±0.06)vs(0.67±0.05),P<0.01],60 min恢复至正常水平;加入PD98059后,与对照组比较,3β-HSD下降了15%[(1.08±0.14)vs(1.27±0.10),P<0.05],睾酮水平下降了68%[(12.89±0.93)vs(40.86±4.07),P<0.01]。用annexin 5刺激PD98059预处理过的间质细胞,与annexin 5组相比,3β-HSD表达量和睾酮水平仍维持在低水平,分别下降了19%[(1.16±0.09)vs(1.43±0.05),P<0.01]和68%[(17.47±3.19)vs(54.09±4.50),P<0.05]。结论 ERK MAPK途径可能是annexin 5调控睾丸间质细胞中睾酮分泌的重要信号通路,其调控睾酮分泌是通过影响3β-HSD的合成而实现的。

Annexin5对雄性SD大鼠生殖相关指标和睾酮分泌的影响

目的探讨膜联蛋白5(annexin5)对雄性SD大鼠体重、睾丸系数、附睾系数、精子相对计数和睾酮水平的影响。方法给雄性SD大鼠腹腔注射3个不同剂量(7.5μg/kg、15μg/kg、30 μg/kg)的annexin5,对照组腹腔注射等量的pH 8.0 Tris-HCl,1次/d,连续20d。分别称重对照组和实验组SD大鼠体重、睾丸、附睾,并对附睾尾进行精子计数。HE染色观察睾丸组织结构。运用化学发光法检测对照组和各实验组SD大鼠血清中睾酮浓度。结果与对照组相比,15 μg/kg实验组大鼠附睾系数与精子相对计数均显著提高,分别提高了12.5%(131.8±9.6vs 1 17.2±5.9)(P<0.01)和31.4%(36.8±5.6vs 31.7±5.3)(P<0.05);其它剂量组与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。HE染色显示各剂量实验组与对照组相比,睾丸的形态结构没有发生明显改变。7.5 μg/kg组和15 μg/kg组大鼠血清睾酮含量显著高于对照组,分别提高了35.5%(36.33±3.89vs26.82±3.75)(P<0.01)和82.8%(49.04±5.17vs26.82±3.75)(P<0.01),30 μg/kg组大鼠睾酮含量虽也有升高,但与对照组比较,结果无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔注射annexin5能影响大鼠睾丸生精、附睾功能及睾酮水平,并与剂量有关。