猪圆环病毒2型灭活疫苗佐剂选择

用水包油佐剂Merckinade SDA 25、HS1010和双向佐剂Montanide ISA 206三种不同佐剂分别制成猪圆环病毒2型灭活疫苗,对三种疫苗的稳定性、黏度、免疫仔猪后的安全性及效力进行了比较。试验结果表明,以3000 r/min离心15 min,三种疫苗均无水析出;三种疫苗的黏度均低于200 cP;三种疫苗按2.0 mL/头的剂量接种21日龄健康易感猪,试验猪体温、采食、饮水、精神状况均正常,均无不良临床反应,剖检后各脏器均无病理变化;加强免疫后21d,各组试验猪采血,检测猪圆环病毒2型抗体效价,结果表明,佐剂MontanideISA206相较MerckinadeSDA25可诱导更高水平抗体效价。攻毒试验结果表明免疫组可以得到100%的保护。根据以上试验结果,确定猪圆环病毒2型灭活疫苗使用Montanide ISA 206。

羊传染性脓疱口炎病毒株的分离鉴定

利用牛肾(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)细胞对上海市崇明区某羊场的痂皮病例进行病毒分离,获得一株羊口疮病毒(orf virus,ORFV),命名为ORFV_(SH-01)。参考NCBI数据库中ORFV的保守基因B2L的序列,设计一对特异性引物,进行PCR扩增并测序。结果表明:接种病料悬液的MDBK细胞出现细胞病变,成功分离到毒株;经PCR扩增和测序,分离的毒株为ORFV,命名为ORFVSH-01。

猪细小病毒S-1A株对细胞的适应性及其培养条件的优化

将猪细小病毒S-1A株在不同的细胞中培养,测定病毒含量,以确定适合猪细小病毒S-1A株增殖的细胞。结果表明:猪细小病毒S-1A株能在猪肾传代细胞系(PK-15)、猪肾原代细胞(PK)、猪睾丸细胞(ST)和仔猪肾细胞(IBRS-2)中生长增殖,不能在幼仓鼠肾细胞系(BHK-21)、绿猴肾细胞(Vero)和鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖;当ST细胞生长至2/3单层时,将猪细小病毒S-1A株种毒液100倍或1000倍稀释后接种ST细胞,37℃培养96~144 h,获得的病毒载量最高。

猪伪狂犬病毒gE基因缺失毒株的构建及其免疫原性的研究

通过CRISPER/Cas9编辑技术编辑实验室分离得到的PRV-SX株的gE基因,并利用蚀斑纯化等方法得到gE基因缺失的突变株。通过T7E1核酸内切酶及测序来鉴定gE基因的缺失,并对gE基因缺失毒株的免疫效果进行了研究。结果表明:应用CRISPER/Cas9编辑技术成功得到了gE基因缺失毒株,用这一毒株制备疫苗免疫仔猪,免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d PRV gE抗体均为阴性;PRV gB抗体呈阳性,在42 d时达高峰。

猪伪狂犬病毒TK基因的扩增及序列分析

为了解猪伪狂犬病毒TK基因的分子特征及分子流行病学特点,利用PCR对猪伪狂犬病毒SX株TK基因进行扩增和测序,并将测序结果与国内外经典毒株、疫苗毒株以及近些年的变异毒株进行序列比对分析。结果表明:SX株TK基因序列包含963 bp的编码区,共编码320个氨基酸;与国内流行的变异毒株核苷酸和氨基酸同源性为100%,与国内外其他经典毒株核苷酸同源性在99.4%—99.7%,氨基酸同源性在99.1%—99.7%。与经典毒株相比,变异毒株TK基因编码的蛋白大部分都出现了第215位由苏氨酸(T)突变为缬氨酸(V)和第284位由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。氨基酸进化分析也表明,SX株及变异毒株与经典毒株呈现各自独立的遗传进化分支。

一株猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其对不同动物的致病性

为了解变异后伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的致病性,采用细胞培养技术从病料中分离PRV,通过PCR方法对PRV相关基因进行扩增,对毒株进行特异性试验和病毒滴度的测定,并通过动物试验对PRV的致病性进行了研究。结果表明:通过PCR可扩增出大小与预期相符的PRV gG基因片段、gE基因片段以及TK基因片段;病毒毒价可达10^(8.0) TCID_(50)∕mL;接种10^(5.0)TCID_(50)∕mL病毒后,家兔于52 h左右全部死亡,小鼠于72 h左右全部死亡,10^(4.0) TCID_(50)∕mL病毒可致28日龄仔猪死亡或发病。本研究可为预防PRV疫病的流行提供防控依据。

猪伪狂犬病研究进展

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)引起的多种家畜和野生动物感染的一种急性传染病,主要症状为发热、奇痒(猪除外)及繁殖障碍。为了对伪狂犬病有一个较深的理解,本文将从伪狂犬病概况和防控措施两个方面进行综述。

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株毒株的鉴定

通过细胞传代,获得了35代次的PRV_(SX)-gE基因缺失毒株。对不同代次的病毒进行TCID_(50)测定、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验,并通过动物感染试验测定毒株对猪的致病性。结果表明:不同代次之间病毒滴度无显著差异,且无支原体和外源病毒污染。PRV_(SX)-gE基因缺失毒株(10^(8.0)TCID_(50)/mL)可致仔猪发病。用PRV_(SX)-gE基因缺失毒株制备的油乳剂疫苗免疫小鼠和仔猪,发现其对小鼠保护率达90%以上,对猪保护率达100%。试验表明,PRV_(SX)-gE基因缺失毒株具有良好的免疫原性。

全悬浮ST_(HN)-XF细胞的纯净性及核型分析

为了建立全悬浮ST_(HN)-XF种子细胞库,本研究将驯化成功的全悬浮ST_(HN)-XF细胞连续传代至F36代,通过纯净性和核型分析,结果显示,F1、F5、F16、F26、F36代的ST_(HN)-XF细胞均无菌、无支原体、无外源病毒,细胞染色体数目均为19对,即38条,结果表明各代ST_(HN)-XF细胞都是纯净的,且核型相同。

猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件。建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90%,扩增相关系数大于0.98。对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强。该方法批内和批间变异系数均小于2%,重复性好。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持。

猪瘟病毒促进细胞自噬并利于病毒增殖

细胞自噬在病毒的增殖、释放中有着重要的作用,目前国内仍然没有猪瘟病毒与细胞自噬相互作用关系的报道。本研究旨在探讨猪瘟病毒Shimen株感染宿主细胞(ST)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过透射电镜和自噬体标记分子LC3的荧光聚点的观察,直观判断病毒对自噬的影响;并通过Western blot,检测LC3蛋白和P62蛋白的表达量,以及LC3蛋白转化分析,确定猪瘟病毒感染促进细胞自噬发生。利用自噬促进剂雷帕霉素、抑制剂3-MA、自噬体与溶酶体融合阻断剂氯喹(CQ),以及自噬基因Beclin 1、LC3蛋白的干扰,调控自噬来研究自噬对病毒增殖的影响。结果表明,病毒感染细胞促进了细胞自噬的发生,且能形成完整的自噬过程,同时病毒利用细胞自噬来促进自身增殖。本研究为探索猪瘟病毒与宿主细胞相互作用关系增加了新的数据。

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。

猪瘟病毒通过网格蛋白介导的内吞途径入侵ST细胞

病毒入侵易感细胞是病毒建立感染的必要过程,猪瘟病毒如何入侵易感细胞尚未明确。笔者对猪瘟病毒入侵细胞与网格蛋白介导的内吞途径的关系进行了初步研究。通过利用抑制剂氯丙嗪和Dynasore及shRNA技术,对网格蛋白及动力蛋白功能进行抑制,干扰网格蛋白介导的内吞途径,发现猪瘟病毒的细胞入侵效率明显下降;通过利用内体酸化抑制剂NH4Cl及shRNA技术下调内体标志蛋白Rab5和Rab7的表达量,发现内体酸化过程受到抑制后猪瘟病毒的感染效率受到了明显抑制。本研究初步证明猪瘟病毒能够利用网格蛋白介导的内吞途径完成对易感细胞的入侵,感染的过程依赖于初级内体和次级内体,为了解猪瘟病毒的感染过程积累了新的数据。

猪圆环病毒2型培养方法的研究

利用有限稀释法从含猪圆环病毒2型(PCV2)的PK15细胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞株,初步研究了该克隆株中PCV2增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光试验结果表明,将该克隆株在方瓶中静置培养连续传代40代后病毒滴度最高可达10^(7.5)TCID_(50)/mL,用生物反应器培养病毒滴度最高可达10^(8.0)TCID_(50)/mL以上。利用常规方瓶培养细胞方法,在37℃培养96h,收获得到猪圆环病毒2型病毒液。本研究结果为进一步开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗奠定了基础。

ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病病毒工艺参数的优化

为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化。结果显示:接种细胞初始密度1.00×10^(6)cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养48 h时,细胞数量扩增了4倍且细胞活力高;猪伪狂犬病病毒接种时初始细胞密度2.00×10^(6)cells/mL、感染量MOI=1.0、培养60~72 h,毒价可达10^(9.00)TCID_(50)/mL。结果表明,优化后的培养工艺适用于摇瓶中ST悬浮细胞及猪伪狂犬病病毒的培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高猪伪狂犬病病毒繁殖能力提供了试验依据。

ST贴壁细胞悬浮驯化及应用

为将ST贴壁细胞通过自主驯化,使其能在ST-S细胞无血清培养基中悬浮生长且能稳定传代,在摇瓶中实现高密度生长,并应用于猪伪狂犬病毒(PRV)悬浮培养,经ST-A低血清培养基适应培养,对一株贴壁的ST细胞进行了无血清的全悬浮驯化,并将PRV在悬浮细胞中连续盲传培养。结果显示:ST悬浮细胞能在无血清培养基中传代,培养48 h至第3代后,所能达到的最终细胞密度为3.00×10^(6 )cells/mL以上;PRV连续培养至第5代,毒价可达到109.0 TCID50/mL。结果表明,用专用培养基可使ST贴壁细胞实现悬浮驯化,并可应用于PRV悬浮培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高PRV增殖效率奠定了技术基础。

猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE株)对怀孕母猪安全性及繁殖性能的影响

为了确定猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE株)对怀孕母猪的安全性及繁殖性能的影响,本研究选用3批疫苗对怀孕母猪进行一次单剂量接种、单剂量重复接种及一次超剂量接种的试验。结果显示,肌内注射猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE株)后,母猪接种部位及全身无不良反应,母猪健康,妊娠正常,无死胎和木乃伊胎,新生仔猪生长发育良好。试验表明,自主研制的猪伪狂犬病灭活疫苗(PRVSX-gE株)对怀孕母猪安全,对怀孕母猪繁殖性能无影响。

不同消毒剂对PRV、PPV和TGEV的灭活效果试验

为了确定癸甲溴铵-碘溶液消毒剂和癸甲溴铵消毒剂对猪主要疫病病原如猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的灭活效果,通过细胞观察法,用不同浓度的癸甲溴铵-碘溶液消毒剂和癸甲溴铵消毒剂对PRV、PPV和TGEV进行灭活来观察其灭活效果。结果表明,癸甲溴铵-碘溶液和癸甲溴铵溶液对细胞的最大无毒剂量分别为1∶80和1∶10。1∶320的癸甲溴铵-碘溶液消毒剂,1∶80的癸甲溴铵消毒剂与相应浓度的中和剂的反应产物已无毒副作用。癸甲溴铵-碘溶液消毒剂1∶800稀释时可使PRV TCID_(50)降低5个滴度,TGEV TCID_(50)降低4个滴度;癸甲溴铵消毒剂稀释到1∶400时,可使PRV和TGEV的TCID_(50)均降低约3个滴度。两种消毒剂对PPV的灭活效果均不理想。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫途径研究

为了确定鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的适宜免疫途径,采用3批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)实验室制品分别以肌肉注射、皮下注射两种途径免疫30 d低抗体幼龄鸽(HI抗体≤2)和120 d低抗体青年鸽(HI抗体≤2),观察试验鸽的精神状况和疫苗的局部吸收情况,每2周对试验鸽进行一次采血,测定HI抗体,直至免疫后20周,分析两种免疫途径免疫试验鸽的临床症状和产生的抗体差异。结果表明:两种免疫途径免疫的试验鸽均无全身及局部不良反应,免疫后2周抗体在4.0 log2以上,两种免疫途径免疫抗体差异不显著(HI抗体差异在0.2 log2以内)。因此,在鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)制造及检验试行规程中规定:该疫苗的免疫途径为肌肉注射或皮下注射。

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫效果试验

猪圆环病毒病（Porcineeircovirusdiseases，PCVDs）是由猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）引发的一种猪传染性疾病。一旦PCV2感染猪后具有免疫抑制特性，能够干扰其它疫苗的免疫效果。近几年我国猪场的PC耽感染已相当普遍，个别猪场猪圆环病毒2型抗体阳性率可达100％。防控PCV2主要有效的手段是接种圆环病毒病疫苗。当前我国市场上有多种类型的圆环病毒病疫苗，猪群免疫后免疫效果参差不齐；为了评估上海佳牧生物制品有限公司研制的圆环病毒2型灭活疫苗免疫效果，现进行以下试验：