中药安全性评价理论创新与技术突破:病证毒理学

目的提出病证毒理学理论及方法体系,皆在促进病证毒理学在中药新药开发、中药临床安全性评价以及中药安全精准用药对策制定方面的科学、合理和高效运用,促进中医药事业健康可持续发展。方法结合病证毒理学实践运用情况,全面定义病证毒理学的外延和内涵,并系统梳理基于病证毒理学的中药安全性研究新理论、新方法和新发现。结果中药毒性主要分为固有毒性和特异质毒性2种类型,由于特异质毒性具有偶发性,易感性和难预测等特点,常规毒理学模式和方法难以评价,为此本团队传承创新中医“有故无殒”毒效思想,2016年首次提出病证毒理学理论和方法,皆在突破常规毒理学模式和方法局限性,科学厘清遗传、体质、疾病和证候等机体因素对中药安全性的影响规律和主次关系,解决中药特异质毒性评价难题。近年来,本团队在不断完善和优化病证毒理学理论和方法体系基础上,以临床真实世界和体内外病证易感模型为主要评价模式,开展了何首乌、补骨脂和淫羊藿等中药及及其相关制剂特异质毒性的易感人发现识别、成因机制解析及风险防控对策研究,破解了系列传统“无毒”中药安全性评价及风险防控难题。结论病证毒理学不仅可以用于特异质毒性中药的易感人群识别、成因机制解析以及风险防控对策研究,还可以用于固有毒性中药的“病(证)-量-时-毒-效”关系以及安全治疗窗研究。病证毒理学创新发展了中药毒理学理论和方法,为中药安全精准用药提供了奠基性理论和技术支撑。

马兜铃酸致肝癌的客观性研究与思考

目的通过梳理马兜铃酸致肝癌的客观性研究,提出风险防控策略。方法简述马兜铃酸致肝癌的研究进展,阐明马兜铃酸与肝癌相关性再研究的科学意义,梳理本课题组关于马兜铃酸致肝癌的客观性、真实性、系统性研究内容,提出含马兜铃酸中药的防控策略。结果与结论马兜铃酸与肝癌发生缺乏相关性;提出含马兜铃酸中药及制剂安全用药的风险防控策略:明确风险获益比,综合分析药品研究数据做出监管决策;针对不同风险水平患者采取分级管理措施;建立科学认知和精准评价使用中药的新方法,健全安全性质量控制制度。

特异质型药物性肝损伤体内评价模型研究进展

目的总结特异质型药物性肝损伤(idiosyncratic drug-induced liver injury,IDILI)的评价研究进展,以期为IDILI评价和临床风险防控提供依据。方法从动物模型、数理模型、细胞模型等多方面论述IDILI模型的研究进展。结果与结论目前关于IDILI机制研究取得了长足进展,并形成了线粒体损伤、免疫炎症、免疫稳态失衡、基因多态性等多种机制假说,并且针对部分假说建立了病证模型用于多种药物IDILI的评价研究。本课题组基于新发现“有毒”中药特异质肝损伤特点,提出了中药“病证毒理学”评价模式和方法,在此基础上证实了何首乌等中药的特异质肝损伤问题,并提出了中药特异质肝损伤免疫应激“三因致毒”机制假说,较好地阐释了中药IDILI发病特点和机制。

基于不良反应监测大数据的药品安全风险发现与识别策略

目的探索如何从国内外海量的中西药不良反应报告中快速发现与精准识别药物安全风险,并进行科学有效地预测与防控。方法以药物性肝损伤数据为例,针对上市后药品安全风险的发现、评价、确证和防控策略进行论述。结果初步探索建立“不良反应监测大数据发现—多模型识别评析—病证毒理学验证”一体化应对策略和方法体系,并成功应用于药物性肝损伤的识别和评析。结论该策略为药物安全性评价领域的持续发展和创新提供了新的视角,也为保障公众安全用药和促进中西药产业的健康发展提供了技术支撑。

复方鳖甲软肝片对非酒精性脂肪性肝病肝纤维化的疗效评价

目的评价复方鳖甲软肝片(biejia-ruangan compound,BRC)对于非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝纤维化的治疗效果。方法回顾性收集并分析2018年1月—2023年2月就诊于解放军总医院第五医学中心的144例NAFLD患者临床资料,根据治疗方案,将采用单纯保肝治疗的76例患者作为对照组,采用保肝治疗联合BRC治疗方案的68例患者作为治疗组,以治疗6个月后肝纤维化改善率为疗效评价标准。肝纤维化改善定义为肝脏纤维化-4指数(fibrosis-4 score,FIB-4)或天冬氨酸氨基转移酶与血小板比值指数(aspartate aminotransferase to platelet ratio index,APRI)或肝硬度检测值(liver stiffness measurement,LSM)下降20%及以上。通过多因素分析评价BRC治疗NAFLD的疗效。结果治疗组的FIB-4、APRI和LSM改善率分别为75.6%、69.9%和88.6%,显著高于对照组的24.4%、30.1%和11.4%(P均<0.05)。治疗组总胆固醇水平较治疗前降低(P<0.05),对照组则无明显变化(P>0.05);2组甘油三酯水平治疗前后均无明显变化(P均>0.05)。Logistic回归结果显示,BRC治疗是NAFLD肝纤维化的保护因素,BRC对NAFLD肝纤维化有治疗效果。结论BRC可显著改善NAFLD患者的肝纤维化程度。

肝癌血清学早期筛查与诊断标志物研究进展

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性程度极高,早期诊断和治疗是提高肝癌患者生存期最为有效的手段,但目前多数肝癌确诊时已是晚期,极大限制了肝癌临床治疗的可用手段。目前常规的早期筛查与诊断策略是利用甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)结合超声检测对肝癌高危患者(尤其是肝硬化患者)进行定期筛查。但AFP灵敏度较低,超声检测又高度依赖医师的临床经验,导致肝癌的早期检出率大大降低。血清标志物筛查作为更符合我国国情的肝癌早期筛查与诊断策略,具有低侵害、低成本、样本易得、患者易于接受等独特优势,已经得到临床的广泛认可,形成了包括单分子蛋白、MicroRNA、代谢组学、蛋白质组学等多种类型标志物。本文对上述类型血清学标志物的研究现状及其存在的问题进行概述,以期为肝癌血清学早期筛查与诊断标志物的推广应用提供科学依据。

磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰,在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低,难以用质谱直接检测。为了解决这个问题,改善质谱对磷酸肽的信号响应,需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展,包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。

超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白

采用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白进行了分析。样品经胰蛋白酶酶切后,进行液相色谱-串联质谱分析和数据库检索。结果表明,分别有5个和7个肽段匹配于人肿瘤坏死因子受体和人Iggamma-1chainCregion。比对分析表明,重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白中检测到的人IgG的7个肽段完全与人IgG1的序列匹配,与其它3个亚型只有部分肽段匹配。说明重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白一级结构正确,Fc片段确实为人IgG1的Fc片段。

NanoLC-ESI MS/MS对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的准确鉴定

NanoUPLC-ESI MS/MS was used to characterize the primary structure of recombinant human necrosis factor-αreceptorⅡ:IgG Fc fusion protein.The result indicated that the IgG Fc was IgG1 Fc but not others.This study is important for this recombinant protein medicine to enter into international market.

复方中药阻断逆转肝纤维化:超越已知的前沿

肝纤维化是慢性乙型肝炎进展为肝硬化的必由之路,也是肝癌发生最重要的危险因素,因此阻断逆转肝纤维化是有效降低慢性乙型肝炎肝硬化和肝癌发生的重要策略。西医目前尚无治疗肝纤维化的有效药物和手段,在我国中药抗肝纤维化具有独特优势,但是由于缺乏严格规范的临床研究,导致缺少高质量循证医学证据支持。笔者团队在“十二·五”“十三·五”国家科技重大专项的资助下,开展了中药复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦阻断逆转慢性乙型肝炎肝纤维化的多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床研究,以肝活组织检查为标准,纳入1000例患者,确证复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦阻断、逆转肝纤维化和肝硬化的确切疗效,并成为首个具有高质量循证医学证据支持的中医药抗肝纤维化研究成果,为全球慢性肝病患者带来巨大希望,助力中医药走向世界。本文重点就这一研究成果进行介绍并对中医药阻断逆转肝纤维化研究的现状和面临问题进行评述。

六味五灵片对刀豆蛋白A诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用研究

目的研究六味五灵片(Liuweiwuling Tables,LWWL)对刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的保护作用及机制。方法将小鼠随机分成正常组对照组、模型组、双环醇组(Bicyclol,39 mg·kg^(-1))、六味五灵片低剂量组(8 g·kg^(-1))、六味五灵片高剂量组(16 g·kg^(-1)),各给药组每天给药1次,连续7 d,末次给药1 h后,除正常对照组外,其他各组尾静脉注射Con A(15 mg·kg^(-1))制备小鼠急性免疫性肝损伤模型。HE染色观察小鼠肝组织病理变化;比色法检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL);实时定量RT-q PCR测定法检测肝组织中白介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)mRNA的表达;流式细胞术(FCM)观察脾脏Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)细胞的变化;免疫印迹(Western blot)法检测肝组织中Th1/Th2转录因子T-bet/GATA-3的表达。结果与正常对照组相比,模型组小鼠血清中ALT、AST、TBIL明显升高,小鼠肝组织病理损伤严重,肝细胞大量坏死、凋亡,表明造模成功。与模型组比较,六味五灵片低、高剂量组小鼠血清中ALT、AST、TBIL的水平明显降低;脾脏中Th1细胞减少,Th2细胞增多。肝组织中IL-12、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达下降,IL-4、IL-10的mRNA表达上升,GATA-3蛋白表达上调,T-bet蛋白表达无明显变化。结论六味五灵片通过调节Th1/Th2的平衡,保护Con A诱导的急性免疫性肝损伤。

利用Oris技术观察多种因素对人乳腺癌细胞迁移的影响

为分析细胞生长的表面材质和细胞因子等不同刺激因素对人乳腺癌细胞二维迁移的影响,保证实验的可重复性,使用新型的Oris细胞迁移分析技术分析了Ⅰ型胶原、Matrigd和TNF-α等因素作用下运用动特征的变化,实验结果表明Ⅰ型胶原能够促进MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的迁移,而Matrigel对细胞迁移无明显影响。同时实验证明TNF-α对MDA-MB-231细胞的迁移有明显的促进作用。上述研究结果表明表面材质和细胞因子等刺激因素均能够影响乳腺癌细胞的迁移特性。实验同时表明Oris技术稳定可靠操作简便,具有良好的应用前景。

基于GST-pull down的小G蛋白Rac1活性检测体系的建立

目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评估该方法的特异性和准确性。结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程。结论:GST-PBD融合蛋白及其整套GST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rac1的活性。

中药复方抗肝纤维化药理作用研究进展

肝纤维化是广泛存在于慢性肝病中以细胞外基质过量沉积为特征的损伤修复反应,在全球具有较高发病率和病死率。在缺乏有效抗肝纤维化西药的同时,许多行之有效的中药复方逐渐得到了认可。本文总结了近年来国内外研究的一些典型中药复方,分别从活血化瘀、补益、清热祛湿和疏肝健脾等4个方面进行综述。旨在方便研究者系统地了解抗肝纤维化中药复方的研究进展,为临床组方以及抗肝纤维化药物的进一步研究提供一定参考。

何首乌及其成分对人正常肝细胞凋亡的影响

目的观察何首乌对人正常肝细胞的毒性和细胞凋亡的影响,探讨何首乌致肝损伤的可能物质和途径。方法以人正常肝(实质)细胞系L02为评价模型,Giemsa染色观察给药后各组细胞形态,流式细胞术检测给药后各组细胞凋亡率及细胞周期。结果与空白对照组比较,何首乌70%乙醇提取物1、2、4 mg原药材/m L对肝细胞形态和细胞周期影响均不明显,给药24 h凋亡率分别为9.51%、10.3%、13.2%;何首乌中3个成分大黄素、大黄酸和没食子酸(25、50、100μmol/L)单独给药,各给药组细胞均可见典型凋亡形态,G1期细胞所占比例明显减小,S期、G2期比例增加,其中3个成分高浓度(100μmol/L)给药24 h凋亡率分别为19.8%、12.0%和13.7%。结论何首乌对人L02细胞有一定的诱导凋亡作用,其所含大黄素诱导凋亡作用强于大黄酸和没食子酸。

苷泰胶囊对GalN/LPS致小鼠急性肝损伤的保护作用研究

目的:研究观察苷泰胶囊对D-氨基半乳糖(GalN)联合细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝脏损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法:将60只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、双环醇阳性药对照组(10mg·kg^(-1))和苷泰胶囊低、高剂量(300、3000mg·kg^(-1))组,每组12只。除正常组、模型组给予等体积生理盐水外,各组小鼠均按给定药物、剂量灌胃7日,每日1次。末次给药1h后,正常组小鼠腹腔注射等容积生理盐水,其他各组均腹腔注射GalN(800mg·kg^(-1))和LPS(10μg·kg^(-1))。给药4h后取血取肝。通过血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量和HE染色结果评价苷泰胶囊对肝损伤的保护效果。采用Real-time PCR检测各组小鼠肝组织TNF-α、IFN-γ、CD14和TLR4等基因的表达。结果:苷泰胶囊可明显降低急性肝损伤小鼠的ALT、AST水平(P<0.05或P<0.01),改善其肝脏病理损伤程度,同时下调TNF-α、IFN-γ、CD14和TLR4等基因的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:苷泰胶囊对GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠具有较好的保护作用,其机制可能与下调LPS受体CD14、TLR4mRNA表达,抑制TLR4信号通路的活性,进而抑制TNF-α、IFN-γ等炎症因子的表达有关。

AFP、AFP-L3、AFP-L3%和IL-6在乙肝肝硬化人群中诊断肝癌的价值

目的探讨不同血清肿瘤标志物在乙肝肝硬化人群中预测和诊断肝癌的临床价值。方法分析99例乙肝肝硬化患者、99例乙肝肝硬化合并原发性肝癌患者的临床资料,分别检测血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和白介素6(IL-6)含量,并计算AFP-L3%(AFP-L3/AFP),比较两组间各血清肿瘤标志物表达水平差异,并计算各血清肿瘤标志物诊断肝癌的敏感度及特异性。结果乙肝肝硬化组与乙肝肝硬化合并肝癌组之间AFP[3.2(2.1,8.5)ng/ml vs 14.1(3.9,128.3)ng/ml]、AFP-L3[0.2(0.1,0.5)ng/ml vs 0.8(0.2,13.8)ng/ml]、AFP-L3%[5.0%(5.0%,5.0%)vs 5.0%(5.0%,11.7%)]、IL-6[8.7(6.3,11.4)pg/ml vs 13.5(10.7,16.5)pg/ml],差异均有统计学意义(P<0.05)。AFP在乙肝肝硬化人群诊断肝癌的敏感度为43.9%,特异性为84.8%;AFP-L3敏感度为48.1%,特异性为83.8%;AFP-L3%敏感度为29.3%,特异性为97.5%;IL-6敏感度为98.9%,特异性为34.3%。结论血清肿瘤标志物AFP、AFP-L3、AFP-L3%均能有效用于乙肝肝硬化人群预测和诊断肝癌,AFP-L3%更具优势;IL-6敏感度虽高,但特异性低,不能有效用于肝癌的诊断。

基于高内涵分析的何首乌对肝窦内皮细胞损伤的配伍减毒研究

目的:观察何首乌对肝窦内皮细胞损伤的配伍减毒情况,为其临床合理用药提供参考。方法:采用高内涵分析技术,检测何首乌与茯苓、甘草、三七在肝窦内皮细胞上的配伍减毒情况。结果:何首乌对肝窦内皮细胞的损伤呈剂量依赖性,在IC50的剂量下,分别配伍不同浓度的茯苓、甘草、三七都有显著的减毒作用,且呈剂量依赖性。何首乌配伍茯苓减毒的效果较好,甘草次之,三七稍差。结论:采用高内涵分析方法更加直观、具体地反映何首乌与茯苓、甘草、三七的配伍减毒效果,为临床用药的安全性、合理性提供依据。

绿茶提取物可致特异质型肝损伤?——与美国最新版药物性肝损伤指南商榷

近年来,绿茶提取物的潜在肝毒性越来越多的引起了人们的关注。本文通过现有绿茶提取物肝损伤相关研究,结合最新药物肝毒性分类,对其肝损伤的客观性和成因机制进行了系统的阐述和分析。进一步根据绿茶提取物致肝损伤的主要风险因素,提出了安全合理使用此类产品的相关建议,以期为绿茶提取物肝损伤机制的深入研究和风险的防控提供有价值的见解,同时,也为绿茶提取物改善健康状况的治疗性使用提供重要的参考。

氧化苦参碱抗猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化作用研究

目的:研究氧化苦参碱对猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化的影响.方法:采用猪血清诱导的肝纤维化模型,肝脏病理学检测天狼星红染色观察纤维化程度,ELISA检测血清中TGF-beta1和IL-10的含量.结果:氧化苦参碱可明显降低实验大鼠肝脏胶原沉积,肝脏羟脯氨酸含量相对于模型组显著下降(P<0.05);与模型组相比,治疗组血清ALT和TGF-beta1的含量显著降低(P<0.05),IL-10含量显著升高(P<0.05).结论:苦参素可明显降低试验所用大鼠肝脏纤维化程度,对猪血清诱导的大鼠肝纤维化有良好的防护作用,对IL-10表达的影响或是其作用机制之一.