马铃薯密码子用法分析及其在t-PA基因密码子改造上的应用

采用bioperl 1.0工具在红旗LINUX系统下自编了密码子分析软件;通过对马铃薯98个蛋白质编码基因序列(codonDNAsequence)的分析,计算出了马铃薯的密码子用法,并确定出了马铃薯的4个高表达优越密码子;依据马铃薯密码子用法和高表达优越密码子分析结果,对t PA基因序列进行了密码子的改造,得到了具有马铃薯密码子使用特点的t PA基因序列,从而为以马铃薯为生物反应器高效生产t PA奠定了分子基础。

大豆耐盐性鉴定体系的建立

采用沙土水溶液的培养方法,以3个主栽大豆品种合丰50、合丰55和绥农28为试验材料,分别在种子发芽期(VE期)、第二片三出复叶长出期(V2期)进行不同浓度的NaCl处理,测定种子发芽率、死亡叶面积率、相对株高盐害率等表型指标,检测丙二醛含量、相对电导率等耐盐性生理指标。数据分析表明,该方法能区分不同品种、不同处理浓度的盐害程度,反映出相同品种、不同处理浓度间的差异,证明该方法能够用于大豆耐盐性鉴定。通过该鉴定体系测定3个大豆品种的耐盐性,最终选出在VE期抑制50%种子发芽NaCl浓度、V2期死亡叶面积率和对照之间存在显著差异的最小NaCl筛选浓度,并把V2期的死亡叶面积率作为衡量耐盐性的主要表型指标,丙二醛含量作为主要生理指标。研究结果可用于大豆耐盐性的鉴定、转基因耐盐大豆的鉴定等领域,具有重要应用价值。

转OsMAPK4基因水稻耐盐性分析

构建了由组成型启动子E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pCME12,利用农杆菌介导法转化黑龙江省主栽品种五优稻1号水稻愈伤组织,Southern杂交检测表明,OsMAPK4基因整合到水稻基因组上,获得了转基因水稻植株。对转基因水稻在种子发芽期和苗期进行了耐盐性分析,结果表明,转基因水稻种子在含0.2mol·L-1NaCl的培养基上能正常萌发;转基因水稻幼苗在0.4mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色,种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株栽至无盐土壤中,植株能萌发出新叶片。

拟南芥MYBC1转录因子介导ABA调节的种子萌发

MYBC1编码具有单一结构域的MYB类转录因子,前期研究中发现它调控拟南芥的抗冷性。为了进一步揭示MYBC1与干旱、盐及ABA的关系,采用Real-time RT-PCR方法分析了MYBC1基因在拟南芥的根中的表达特性。结果表明,在拟南芥的根中MYBC1不能被干旱与高盐诱导,但能够被冷及外源的ABA诱导表达。通过对mybc1突变体的进一步研究发现,MYBC1还参与了ABA介导的种子萌发,mybc1突变体表现出对ABA更强的敏感性,但突变体在耐盐及耐旱能力上并没有改变。由此可知,MYBC1参与了ABA介导的种子萌发,可能没有参与抗盐及抗旱性。

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。

苜蓿高效再生体系的建立

以黑龙江主栽苜蓿品种肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号苜蓿、公农2号苜蓿为受体材料,分别研究了外植体类型对不定芽分化的影响,基因型、PGRs的不同配比对子叶节不定芽分化的影响,并确定了芽分化、芽伸长及再生植株生根时的最佳培养基。结果表明,当BA浓度为1.0mg/L时最适于子叶节的分化;当BA浓度为0.5mg/L时植株生长最佳。芽分化培养基为:MS+1.0mg/L BA,30g/L蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8;芽伸长培养基为:MS+0.5mg/LBA,30g/L蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8;再生植株生根培养基为:MS+1.5mg/L IBA,15g/L蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8。

干旱、高温胁迫下大豆SSR标记与产量性状关联分析

研究49对SSR标记对36份在干旱、高温处理下的大豆材料多态性扫描和群体多样性分析。STRUCTURE2.3.2软件群体结构分析,Tassel2.1软件MLM模型对始花期等5个农艺性状关联分析,发掘优异等位变异。结果表明,1 49个具有多态性的标记共检测出156个等位变异;标记位点的Shannon指数分布范围0.4506~1.3265,多态性信息值PIC分布范围0.2454~0.9059。2 36份大豆材料被分为2个亚群。关联分析发现12个位点与大豆产量性状相关,研究各个关联位点找到Satt575-2、Sat_201-1、Satt686-2等表型效应明显的优异等位变异,为后期杂交育种亲本选择以及标记辅助育种提供基础。

大豆GmRLP19基因克隆及胁迫应答模式分析

以大豆品种Williams82为试验材料,克隆GmRLP19基因,通过生物信息学分析qPCR检测探讨该基因不同生育期品种、不同组织、不同非生物胁迫下表达模式。结果表明,该基因编码区全长3 138 bp,编码1 045个氨基酸,编码蛋白具有胞外信号肽,LRRNT域,富含亮氨酸重复结构域,跨膜结构域和一段胞内短肽,属于受体类蛋白家族,定位于质膜。该基因在不同生育期品种间差异表达,在豆和豆荚中特异性表达,且在5种非生物胁迫中均有响应。研究为探究WRKY20基因功能及挖掘和完善基因调控通路奠定基础。

草莓叶盘再生和遗传转化体系的优化

农杆菌介导的叶盘法是目前草莓遗传转化的主要方法,建立高效稳定的叶盘再生体系是获得转基因草莓的必要条件。文章探讨了影响草莓离体叶片不定芽诱导的主要因素,建立了一个稳定的草莓植株再生体系,确定草莓品种弗吉尼亚不定芽诱导的最佳培养基组分为:MS+TDZ 2 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1+2,4-D 0.2 mg.L-1,pH 5.8。发现叶盘近轴面向下放置能显著提高再生频率,且叶片幼嫩程度与草莓不定芽分化率呈正相关。并以此体系对草莓叶盘遗传转化进行优化,发现草莓品种弗吉尼亚遗传转化最佳预培养时间为2 d,最佳侵染时间为7 min。同时,利用该体系,将由不同启动子诱导的组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator,t-PA)基因对草莓进行遗传转化。

水稻Os03g19020基因的克隆及亚细胞定位分析

Os03g19020基因是从水稻苗期冷害基因表达谱芯片中筛选到一个冷胁迫诱导表达的基因,Real-time PCR验证。结果表明,Os03g19020基因受冷诱导表达,响应迅速;氨基酸序列分析发现Os03g19020编码PHDfinger家族蛋白,具有典型的C4HC3保守结构域;同源性分析结果显示,03g19020与籼稻品种OsI_11202蛋白相似性达98%。将03g19020基因融合GFP基因,转化烟草原生质体细胞,结果表明,03g19020蛋白主要定位在细胞核内。

GmSTK12基因转化大豆及对转化体生物量影响的研究

大豆GmSTK12基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶。研究通过同源克隆方法获得大豆GmSTK12基因,并成功构建基因植物表达载体,利用农杆菌介导的子叶节转化法对大豆品种东农50作遗传转化,测定获得的3份GmSTK12基因过量表达大豆T1及T2代材料生长情况。结果表明,GmSTK12基因过量表达使大豆叶片长宽比、侧根数量、根长显著高于对照品种;叶面积从V6期开始增加,约为对照品种2倍;GmSTK12基因过量表达使植株地上部分鲜重与干重、根鲜重与干重显著高于对照品种;GmSTK12基因过量表达使植株单株粒数、单株荚数及百粒重显著高于对照品种;叶绿素含量显著提高。研究表明,GmSTK12基因具有增加大豆生物量功能。

本科生心理健康状况调查分析

采用贝克抑郁自评量表、一般自我效能感量表、社会支持问卷调查了368名东北农业大学本科生的抑郁状况及其与自我效能感和社会支持的关系。结果为男生的自我效能感高于女生;一年级学生的抑郁水平较高,而客观支持水平较低;主观支持、客观支持和自我效能感对抑郁存在负向预测作用;增加大一学生的自我效能感和社会支持可以促进其心理健康发展。

大豆GmANKTM家族非生物胁迫生物信息学分析

ANKTM(Ankyrin repeats transmembrane)蛋白属锚蛋白超家族,包含ANK基序和跨膜结构域,在非生物胁迫、生物胁迫、诱发衰老中起重要作用。为了解大豆ANKTM(Ankyrin repeats transmembrane)家族成员及其胁迫响应规律,利用生物信息学和q-PCR方法研究大豆ANKTM家族成员。结果表明,从大豆中鉴定出62个ANKTM家族基因,分为5个亚家族。该家族编码蛋白含346~1 039个氨基酸,分子质量为37.88~114.83 ku,等电点(pI)为4.46~9.61。分析蛋白结构域发现,GmANKTM家族含ANK基序和跨膜结构域,58个基因含PGG结构域,此外还含ACBP、SBP、DHHC、G-PCR等其他结构域。除ANK基序、跨膜结构域和PGG结构域外其他结构域主要集中在第5亚家族。其余亚家族结构域分布位置和数量相近。启动子区域顺式元件分析发现,GmANKTM家族基因含光响应元件、激素响应相关元件和逆境响应相关元件。组织分析发现GmANKTM家族第5亚家族组织表达量高于其他亚家族。利用大豆转录组数据库分析发现,GmANKTM家族基因受盐胁迫和干旱胁迫强烈诱导。

UPF0497家族成员At2g39530基因参与植物非生物胁迫应答的研究

UPF0497(Uncharacteristic protein family 0497)是一个功能未知的膜蛋白家族,近期研究表明,该家族5个成员与拟南芥凯氏带的形成有关。研究对UPF0497家族成员启动子序列进行分析,发现该家族两个成员(At2g39530和At2g03700)启动子序列中具有DRE顺式作用元件,推测该蛋白家族成员可能参与植物非生物胁迫应答。选取At2g39530基因进行研究,结果表明At2g39530是一种根增强性表达并且存在于细胞核与细胞质中的蛋白,以ABA非依赖途径对非生物胁迫产生响应。这一结果为研究UPF0497家族在非生物胁迫中的作用提供参考。

大豆EST-SNP的挖掘、鉴定及其CAPS标记的开发

采用生物信息学方法将大豆EST序列联配到大豆基因组序列上,挖掘到大豆EST-SNP位点537个。对其靶向基因进行功能注释分析,发现他们主要参与亚细胞定位、蛋白质结合与催化以及代谢等与大豆重要农艺性状形成相关的生物过程。同时开发了简便易行的SNP检测方法,利用EMBOSS软件筛选导致酶切位点改变的EST-SNP,分别以大豆绥农14、合丰25、Acher、Evans、Peking、PI209332、固新野生大豆、科丰1号、南农1138-2的DNA及其混合的DNA为模板,设计引物进行PCR扩增,发现44个PCR产物中有36个测序峰图在预期的EST-SNP位点表现出多态性。酶切分析发现26个PCR产物具有酶切多态性,可以作为CAPS标记。结果表明该EST-SNP挖掘体系及其CAPS标记转化系统具有高效率、低成本等优点,有利于促进大豆的遗传育种研究。

两种紫花苜蓿苗期耐盐生理特性的初步研究及其耐盐性比较

为研究2种紫花苜蓿:肇东苜蓿和农菁1号苜蓿的耐盐程度及其在盐胁迫处理下的生理反应规律,在1/2Hogland营养液水培条件下,用0,50,100,200,300,400mmol/L NaCl溶液模拟盐胁迫处理2种紫花苜蓿幼苗,观察记录各处理的盐害情况,分别测定胁迫前和胁迫3,6,9,12,15,21d的丙二醛(MDA)、叶绿素(Chl)和脯氨酸(Pro)含量,分析了不同胁迫程度和胁迫时间下相关生理指标的变化情况,并采用隶属函数法对二者的耐盐性进行了综合评价。结果表明,低浓度盐胁迫对其生长无显著影响,2种苜蓿具有较强的耐盐性,能够抵抗一段时间较高浓度(200mmol/L)的盐胁迫。随着浓度的增加,MDA含量逐渐升高,但随胁迫时间的延长,在200,300mmol/L处理下,2种苜蓿的MDA含量表现出先增加,后下降,然后又上升的动态变化趋势。随着胁迫浓度的增加和时间的延长,二者受到的盐害逐渐增大,Chl含量逐渐降低,Pro含量大量累积,但二者的Pro累积程度与它们的耐盐表现并不完全一致。综合评价结果表明,在100,200mmol/L NaCl胁迫下,农菁1号苜蓿比肇东苜蓿更耐盐;而300,400mmol/L NaCl处理时,肇东苜蓿的耐盐性大于农菁1号苜蓿。

野生大豆GsGST19基因的克隆及其转基因苜蓿的耐盐碱性分析

谷胱甘肽S-转移酶对植物抵御逆境胁迫和解除细胞毒素起着重要作用。本研究从野大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到GsGST19基因,将其转化苜蓿,获得超量表达的转基因苜蓿,并对转基因苜蓿进行耐盐碱性分析。结果显示在正常培养条件下,转基因苜蓿株系19-4和19-9的GST酶活性分别是非转基因株系的1.52倍和1.49倍。在100mmol L-1 NaHCO3处理14d后转基因株系生长状态良好,而非转基因对照株系明显萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05),而叶绿素含量和根系活力显著高于非转基因对照(P<0.05),说明超量表达GsGST19基因增强了苜蓿的耐盐碱能力。

电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

电子克隆是随着基因组计划和EST计划的实施而发展起来的,是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此,电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源,介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的应用现状与前景。

拟南芥bZIP1转录因子通过与ABRE元件结合调节ABA信号传导

ABA作为一种重要的植物激素和生长调节剂,介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适应。bZIP类转录因子可以通过ABA依赖途径和ABA非依赖途径调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。本研究通过AtbZIP1T-DNA插入突变的拟南芥植株ko-1(SALK_059343)和ko-2(SALK_069489C)在ABA处理后的表型实验,验证了AtbZIP1参与ABA依赖的信号传导通路。采用"三引物法",分别在DNA水平和RNA水平通过PCR和RT-PCR验证了AtbZIP1基因在拟南芥突变体中的沉默效果。定量分析数据表明,在种子萌发阶段,经过0.6μmolL–1ABA和0.8μmolL–1ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株萌发率和叶片展开/绿色率比野生型植株高,在幼苗生长阶段,经过50μmolL–1ABA处理后,AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株根长比野生型植株长。为了确定AtbZIP1基因参与ABA信号传导是否依赖于ABRE元件,在大肠杆菌中表达了AtbZIP1HIS6融合蛋白,并设计了核心序列为CACGTG的ABRE元件。凝胶阻滞电泳结果表明AtbZIP1融合蛋白可以与ABRE元件特异性结合。半定量RT-PCR分析表明,AtbZIP1基因的缺失改变了下游的ABA响应基因的表达。该结果表明,AtbZIP1可以通过与ABRE元件结合调节植物对ABA处理的敏感性和下游ABA响应基因的表达,从而参与植物的ABA信号传导通路。

野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及功能分析

干旱、盐碱和低温等非生物逆境是危害作物诸多因素中最为严重的自然灾害,它可以使作物减产,甚至死亡。目前通过生物技术手段获得可利用的抗性基因是提高植物抗性的重要途径。东北野生大豆具有丰富的基因资源,是基因克隆的理想材料。从低温(4℃)、干旱(30%PEG)及盐胁迫(200mmolL-1NaCl)处理的东北野生大豆幼苗叶片中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链,并以此链为模板,从已构建的盐胁迫全长cDNA文库和东北野生大豆盐胁迫EST数据库中筛选出与渗透胁迫直接相关的EST序列,根据该序列设计一对PCR引物扩增S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的全长序列,经Blast比较分析,确定所获得的SAMS基因全长序列。构建以pBI121为基础的CaMV35S启动子调控的植物表达载体;利用农杆菌介导法将其导入烟草,获得了180株转基因烟草,并进行了低温、干旱和盐胁迫处理,通过测定在不同胁迫处理下的生理指标,分析了基因的功能。野生大豆的SAMS基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草的抗低温、干旱和耐盐能力。