非洲猪瘟病毒P30蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化重组非洲猪瘟病毒P30蛋白,并进一步制备抗P30重组蛋白的多克隆抗体,为非洲猪瘟病毒诊断试剂盒的研发提供实验材料和理论依据。根据GenBank中非洲猪瘟结构蛋白P30序列,经密码子优化后合成相应的基因序列,构建重组表达质粒pET-32a-P30并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达纯化后获得重组P30蛋白,并制备抗P30的多克隆抗体。结果表明:16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达12 h获得质量浓度为0.6 mg/mL以上的重组P30蛋白,Western blot证实原核表达的P30具有较好的免疫原性,ELISA检测纯化后的多克隆抗体效价高达1∶5120000,且具有良好的抗原特异性。

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID_(50))为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^(7).0TCID_(50)/mL免疫怀孕75~90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明:猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10^(6)个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10^(6)个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量可稳定达到1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在15L生物反应器上的最适培养条件为pH值7.0~7.2、DO值50%、转速80~100 r/min,培养36h收获的病毒液含量可稳定在1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;在50L生物反应器上放大培养收获的病毒液含量为1×10^(7).8TCID_(50)/mL。母猪和仔猪中和抗体效价均≥1∶32,免疫保护力为100%。说明本试验条件下成功建立并优化了生物反应器全悬浮培养制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,生产的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的免疫原性较好。

猪圆环病毒2型抗原乳胶免疫层析试纸的构建与应用

为构建一种强特异性、高灵敏度、检测快速、操作简便的猪圆环病毒2型(PCV2)抗原诊断方法,本研究通过原核表达系统表达Cap蛋白并制备相应的多克隆抗体。用多克隆抗体和乳胶微球制备免疫探针,将单克隆抗体和羊抗兔二抗分别包被于硝酸纤维膜(NC膜)上的检测线(T线)和质控线(C线)。对工艺参数进行优化后进行试纸条的性能验证,结果显示,该试纸仅在PCV2抗原阳性血清下呈现阳性结果,与其他病毒抗原阳性血清无交叉反应;检出限为0.5 ng/m L;对150份临床样本进行检测,以PCR检测试剂盒的结果为金标准,试纸条的样本检出率为93.33%(140/150);该试纸在常温、20%湿度环境下可保存至少12个月。结果表明,本研究构建的PCV2抗原检测试纸具有强特异性、高灵敏度、良好稳定性、检测快速、操作简便的特点,可用于猪圆环病毒2型感染的早期诊断,对猪圆环病毒2型的预防具有重要意义。