有机溶剂透性化处理谷氨酸脱羧酶工程菌制备γ-氨基丁酸的研究

为了降低细胞壁和细胞膜的传质阻力对全细胞催化过程的不利影响,采用有机溶剂对表达重组谷氨酸脱羧酶(GAD)的工程菌BL21(DE3)-p ET28a-gad B进行了透性化处理。结果表明,菌体GAD表观催化活力的改善程度与有机溶剂的介电系数和疏水性具有较强相关性,低介电常数(<6),高疏水性(log P>0.68)的有机溶剂可以有效提高工程菌的GAD催化活性,其中最有效的透性化试剂为二甲苯(介电常数为2.4,log P为3.1)。当二甲苯的用量为5μL?mg?1(干重细胞)、处理时间5 min时,菌体表观催化活力达到最优值,为7.94 U?mg?1(干重细胞),是处理前表观催化活力的12.4倍。为了充分利用菌体的催化活力,采用海藻酸钙包埋的方法对二甲苯处理过的菌体进行固定化,结果发现固定化的透性化菌体可以较好地保持催化活力,反复催化10次后发现,第10次的GABA产率为第1次GABA产率的72.04%。研究为系统的选择有机溶剂来有效提高GAD工程菌表观催化活性提供了参考,同时制备的固定化的透性化菌体显示了良好工业应用前景。

利用荧光光谱法研究脲和盐酸胍诱导谷氨酸脱羧酶的去折叠

利用荧光光谱法研究了盐酸胍和脲诱导的谷氨酸脱羧酶野生酶和突变酶K413A的去折叠过程,以探索与酶稳定性相关的构效关系。以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A在激发波长为280 nm的荧光图谱中色氨酸的最大发射峰均发生红移,色氨酸荧光强度呈现先上升再下降的趋势;以脲为变性剂时,两种酶荧光图谱中色氨酸的最大发射峰同样发生红移,但色氨酸荧光强度持续下降。无论是以盐酸胍还是以脲作为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A的去折叠过程都符合"三态模型",说明随着变性剂浓度的增加,野生型酶和突变酶K413A先从天然态转变为部分折叠中间态,并最终转变为去折叠状态。此外,考察了变性剂对谷氨酸脱羧酶活力的影响,当以盐酸胍为变性剂时,野生型酶和突变酶K413A半失活的盐酸胍浓度分别为0.4 mol×L^(-1)和0.7 mol×L^(-1),而半失活的脲浓度分别为1 mol×L^(-1)和2 mol×L^(-1)。研究表明,突变酶K413A的热力学稳定性比野生型酶更强,K413位点与GAD的结构刚性有重要联系。

应用拉氏图信息提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化性能

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。