腺病毒介导EGFP共转染p16基因对腺样囊性癌细胞的影响

目的探讨以抑癌基因p16为靶基因,腺病毒(Ad)为载体的重组基因治疗药物Ad5CMV-p16对人涎腺腺样囊性癌细胞系(SACC-83)的作用。方法含有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的腺病毒载体(Ad5CMV-EGFP)转染SACC-83细胞,确定重组腺病毒载体转染效率。Ad5CMV-EGFP为对照组,Ad5CMV-p16和Ad5CMV-EGFP共转染为实验组分别感染SACC-83细胞,采用RT-PCR方法检测p16基因的表达。应用倒置显微镜观察细胞形态,MTT检测细胞的增殖率,软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果Ad5CMV-EGFP在1000 viral particles[vp]/cell时转染效率达95%以上。RT-PCR实验组可检测到p16基因表达,而对照组未见表达。细胞单纯转染Ad5CMV-EGFP或共同转染Ad5CMV-p16后,随时间增长细胞增殖率逐渐下降,共同转染组较单纯转染Ad5CMV-EGFP组比变化更明显。软琼脂克隆形成实验显示,共转染组较对照组有更强的抑制细胞克隆形成能力。流式细胞仪检测细胞周期变化显示Ad5CMV-EGFP和Ad5CMV-p16共转染组G0-G1期细胞比例比单独转染Ad5CMV-EGFP组大。结论Ad5CMV-p16在体外能明显抑制SACC-83细胞增殖能力和活性,有望成为一种有效的基因治疗药物。

大鼠颌下腺细胞培养方法建立及生物学特性研究

目的:建立大鼠颌下腺细胞体外培养的方法,为涎腺细胞的体外扩增及基因治疗涎腺疾病奠定基础。方法:无菌条件下取1日龄Wistar大鼠颌下腺,经LB3、胰酶联合消化后原代细胞接种于含2%胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素等的DMEM/F12培养液,相差显微镜观察原代及传代细胞的形态特征,免疫组织化学染色鉴定细胞来源,PAS染色观察体外培养第2代细胞合成、分泌多糖功能。结果:体外培养的大鼠颌下腺原代细胞为圆形、三角形、多边形。细胞传至第2代生长良好,形态未发生改变。体外培养的第2代细胞角蛋白、E-钙联蛋白免疫组织化学染色、PAS染色均为阳性,表明细胞为上皮来源且具有合成、分泌多糖类物质的功能。结论:酶联合消化法成功地分离、体外培养了大鼠颌下腺细胞,第2代细胞仍可保持腺细胞的生物学特征。

腺病毒介导的TRAIL基因对舌鳞状细胞癌细胞株的影响

目的探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒(Ad)为载体,巨细胞病毒启动子(CMV)为启动子的重组基因治疗药物AdCMV-TRAIL诱导鳞状细胞癌细胞系TCa83凋亡的作用。方法用重组绿色荧光蛋白基因(EGFP)的腺病毒AdCMV-EGFP为对照组,转染TCa83细胞确定重组腺病毒的转染率。在细胞转染1、3、5、7 d时,应用荧光倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。以AdCMV-TRAIL为实验组转染TCa83细胞,采用RT-PCR方法检测细胞TRAIL的表达。结果AdCMV-EGFP在1 000 particles/cell时转染率为100%。细胞转染AdCMV-TRAIL和AdCMV-EGFP后,随时间延长细胞存活率逐渐下降,但AdCMV-TRAIL组较AdCMV-EGFP组下降更快(P<0.001)。AdCMV-TRAIL和AdCMV-EGFP均能诱导TCa83细胞凋亡,而AdCMV-TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdCMV-EGFP组大(P<0.000 1)。通过RT-PCR可检测到594 bp的TRAIL基因。结论AdCMV-TRAIL在体外能抑制TCa83细胞的活性,并能促进其凋亡。

腺病毒介导肿瘤坏死因子样弱凋亡因子转染对大鼠骨髓基质干细胞内皮分化的影响

目的研究转染腺病毒介导的肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis,TWEAK)对大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,MSCs)内皮分化功能的影响。方法用密度梯度离心法培养纯化扩增大鼠MSCs细胞,将实验细胞分为转染Ad5CMV-TWEAK的实验组和未经转染的对照组,转染后用生长因子诱导其分化,用CD34和Ⅷ因子相关抗原染色鉴定其分化能力;细胞计数法观测转染TWEAK后MSCs内皮分化细胞增殖的影响;胶面生长实验观察转染TWEAK对MSCs微血管形成能力的影响。结果大鼠MSCs转染TWEAK基因经诱导分化后的CD34和Ⅷ因子相关抗原染色阳性细胞数量增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。转染组内皮分化细胞数量增长较快,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。胶面生长实验显示转染TWEAK组细胞微血管新生明显。结论TWEAK基因能促进MSCs向内皮分化,并能促进内皮细胞增殖,在一定的条件下,可促进微血管新生,这为进一步研究其作为诱导体外接种细胞血管发生的基因奠定了基础。

腺病毒介导TWEAK对大鼠骨髓间充质干细胞影响的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的TWEAK基因对骨髓间充质干细胞(Bone M esenchym al Stem Cells,BMSCs)细胞的影响。方法:构建含有TWEAK基因的腺病毒载体Ad5CMV-TWEAK和含绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体Ad5CMV-EGFP;利用全骨髓贴壁法分离纯BMSCs,通过转染Ad5CMV-EGFP确定病毒对BMSCs的转染效率;以未经转染的BMSCs细胞为空白对照组,以转染Ad5CMV-EGFP为实验对照组,以转染Ad5CMV-TWEAK为实验组,通过计数细胞和测定细胞碱性磷酸酶含量观察转染TWEAK对BMSCs增殖和骨形成能力的影响。结果:Ad5CMT-EGFP对大鼠BMSCs的感染率在300partic les/cell时可达到85%;感染后72小时组实验组与空白对照组差异有统计学分析意义(P<0.05),实验对照组与空白对照组差异无统计学分析意义;感染后15 d内各时间点3组间碱性磷酸酶的分泌量经t检验,差异无统计学意义。结论:腺病毒介导的TWEAK基因对于BMSCs具有增殖作用,但并不通过碱性磷酸酶影响BMSCs成骨能力,其在骨形成中的作用需要进一步探讨。

腺病毒介导的TRAIL基因诱导腺样囊性癌细胞凋亡研究

目的:探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒(Ad)为载体的重组基因治疗载体AdCMV-TRAIL诱导腺样囊性癌细胞系ACC-2凋亡的功能。方法:用携带绿色荧光蛋白基因EGFP的AdCMV-EGFP检测腺病毒载体对ACC-2的转染效率;将携带TRAIL基因的AdCMV-TRAIL转染ACC-2;应用RT-PCR方法检测转染后TRAIL基因表达;应用倒置显微镜和荧光倒置显微镜观察细胞形态,MTT方法检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率。结果:AdCMV-EGFP在1000p/cell时转染效率为100%;RT-PCR在实验组检测到594bp的TRAIL基因;AdCMV-TRAIL组和AdCMV-EGFP组的细胞存活率随着时间逐渐下降,且转染AdCMV-TRAIL的肿瘤细胞比转染AdCMV-EGFP的肿瘤细胞下降快,统计学分析有显著差异(P<0.001)。AdCMV-TRAIL和AdCMV-EGFP均能促进腺样囊性癌细胞凋亡,且转染AdCMV-TRAIL引发细胞凋亡的程度明显较AdCMV-EGFP组大,统计学分析有非常显著的差异(P=0.0005)。结论:Ad-CMV-TRAIL在体外能明显抑制ACC-2细胞的活性,有效促使其凋亡;AdCMV-TRAIL可以成为腺样囊性癌转基因治疗的新策略。

hTERT启动TRAIL基因的腺病毒载体对人舌鳞癌细胞影响

目的:探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒(Ad)为载体,人端粒酶(TERT)启动子引导的重组基因治疗药物AdTERT-TRAIL诱导人鳞状细胞癌细胞(TCa8113)凋亡的作用。方法:含有绿色荧光蛋白基因(EGFP)的腺病毒载体(AdTERT-EGFP)转染TCa8113细胞,确定重组腺病毒载体转染效率;AdTERT-EGFP为对照组,AdTERT-TRAIL为实验组感染TCa8113细胞,采用RT-PCR方法检测TRAIL的表达。应用倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:AdTERT-EGFP在1000p/cell时转染效率为100%。RT-PCR可检测到594bp的TRAIL基因。细胞转染AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP后,随时间细胞存活率逐渐下降,但AdTERT-TRAIL组较AdTERT-EGFP组下降更快,统计学分析有显著意义(P<0.001)。AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP均能诱导TCa8113细胞凋亡,而AdTERT-TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdTERT-EGFP组大,统计学有显著差异(P<0.0001)。结论:AdTERT-TRAIL在体外能明显抑制TCa8113细胞的活性,并能促进其凋亡。

TWEAK诱导骨髓间充质干细胞增殖作用的初步实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)基因转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后对其增殖功能的影响。方法全骨髓贴壁法筛选培养幼年大鼠BMSCs,用腺病毒载体Ad5CMV-TWEAK转染TWEAK基因,通过逆转录-聚合酶链式扩增实验(RT-PCR)观察大鼠BMSCs细胞转染后TWEAK蛋白的表达情况。实验分成3组,即转染Ad5CMV-TWEAK的实验组,转染Ad5CMV-EGFP的对照组及未转染任何基因的空白对照组。用MTT法比较各组BMSCs细胞的增殖变化情况。结果全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,RT-PCR可证明Ad5CMV-TWEAK成功的转染BMSCs细胞,转染后在BMSCs产生较高的表达。MTT值经χ2检验,TWEAK组与无干预组比较差异显著(P<0.05),而EGFP组与无干预组无显著差异(P>0.05)。结论TWEAK转染有刺激BMSCs的增殖作用,如进一步证明其促分化作用,其在骨修复材料的改进以及种植体涂层修饰方面将有广阔的应用前景。

腺病毒介导肿瘤坏死因子样弱凋亡因子转染对大鼠骨髓基质干细胞内皮分化的影响

目的研究转染腺病毒介导的肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis，TWEAK）对大鼠骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）内皮分化功能的影响。方法用密度梯度离心法培养纯化扩增大鼠MSCs细胞，将实验细胞分为转染Ad5CMV-TWEAK的实验组和未经转染的对照组，转染后用生长因子诱导其分化，用CD34和Ⅷ因子相关抗原染色鉴定其分化能力；细胞计数法观测转染TWEAK后MSCs内皮分化细胞增殖的影响；