果胶酶高产菌株EIM-4的鉴定及其液体发酵条件优化

目的:通过了解高产果胶酶菌株EIM-4的背景信息及优化其最适的产酶条件,为下一步工业化生产提供依据。方法:通过基于18S rDNA序列的系统发育进化分析对果胶酶高产菌进行鉴定,通过单因素试验和均匀设计获得最适产酶条件。结果:通过对18SrRNA基因的分子系统进化分析,菌株EIM-4被鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。通过单因素和均匀设计试验确定最佳产酶培养基为(g/L):橘皮粉32.9,黄豆粉10.7,(NH4)SO42.1,CaCO31.0,pH自然。结论:Aspergillus niger EIM-4的液体发酵产果胶酶的活力可达15159.82U/mL。

侧孢短芽胞杆菌产生线虫侵染性蛋白酶的优化

采用单因素试验确定侧孢短芽胞杆菌G4产线虫侵染性蛋白酶的最佳碳氮源,通过Placket-Burman设计筛选影响蛋白酶活力的主效因子,最陡坡试验和Box-Behnken设计获得主效因子的最佳水平,建立线虫侵染性蛋白酶的最佳生产体系:葡萄糖9.78 g/L、牛肉膏16.65 g/L、磷酸氢二钾0.75 g/L、可溶性淀粉12.5 g/L、氯化钠0.75 g/L、硫酸镁0.5 g/L、初始pH值自然、装液量50 mL,37℃摇瓶培养32 h,蛋白酶活力可达12 379.41 U/mL,较优化前的2 476.3 U/mL提高了4倍。

黑曲霉EIM-6 pelA基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆黑曲霉EIM-6果胶裂解酶A基因pelA,用于分析果胶裂解酶A的功能与结构。方法与结果:根据GenBank上黑曲霉pelA保守序列设计引物,采用RT-PCR获得黑曲霉EIM-6pelA基因;序列分析表明,pelA基因具有4个内含子,开放读框为1140 bp,编码379个氨基酸残基,含有由20个氨基酸残基构成的信号肽序列;生物信息学分析表明,果胶裂解酶A为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的跨膜结构域,β片层结构是该蛋白的主体结构,空间结构是由反平行的β片层结构为基础包围组成的大环,保守功能区域为Pec_lyase_C结构域。结论:克隆获得黑曲霉EIM-6pelA基因,并进行了生物信息学分析,为蛋白质工程改造果胶裂解酶A奠定了基础。

黑曲霉果胶裂解酶的生物信息分析

用生物信息方法对果胶裂解酶(PNL)基因的核酸序列及其推导氨基酸序列的组成、亚细胞定位、疏水性/亲水性以及二、三级结构等进行分析。结果表明,黑曲霉的PNL为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的信号肽,无跨膜结构区,保守功能结构域为Pec_lyase_C。二级结构主要构成是不规则卷曲,具有以β片层结构为基础的相似三维空间结构。

果胶酶高产菌株EIM－6的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化

通过筛选得到一株适合液体深层发酵培养的高产果胶酶菌株EIM-6,基于形态学与ITS序列分子系统进化分析,鉴定为Aspergillus niger.运用单因子实验确定EIM-6产果胶酶最适碳源和氮源.在此基础上,通过Plackett-Burrman设计对影响其产酶的相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的3个因素.然后通过最陡爬坡实验在上升最高点处由中心组合实验和响应面分析确定其最适产酶条件.实验优化的最优产酶条件为:w(橘皮粉)4.09%,w(麸皮)3.16%,w((NH4)2SO4)0.35%,w(K2HPO4)0.3%,w(CaCO3)0.24%,初始pH 6,接种量107/mL,转速250 r/min,28℃培养80 h酶活达30 231 U/mL,与初始相比,酶活提高2.07倍.

黑曲霉原生质体诱变选育果胶酶高产菌株

通过UV和NTG诱变筛选获得了2株高产果胶酶突变株。以果胶酶产生菌黑曲霉EIM6为诱变材料,采用1.5%的溶壁酶和1.5%的纤维素酶处理其对数生长期菌丝体2 h获得高质量的原生质体。采用UV25S或50μg/mL NTG诱变30 min,构建原生质体突变库,经刚果红果胶平板筛选获得果胶酶突变株,通过液体深层培养复筛获得高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5,酶活力分别从46 598.08、46 598.08 U/mL提高至68 596.57、68 879.56 U/mL,分别提高了47.21%、47.82%。连续8次传代经发酵测酶活力表明高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5具有较高的遗传稳定性。

福州森林红壤细菌的菌群结构及其功能分析

福建地区是我国的第二大林区,土壤类型主要表现为红壤。对福州地区森林中因木材腐朽而形成的树洞中的土壤样品进行筛选,构建了一份具有强木质纤维素降解能力的酸性红壤的细菌16S rRNA基因文库,利用限制性片段长度多态性(RFLP)对随机克隆进行筛选;对该生态环境下的细菌菌群进行了系统发育分析。结果表明土壤pH偏酸性严重影响了细菌类群的多样性,酸杆菌门Acidobacteria(71.5%)和变形菌门Proteobacteria(24.1%)是该酸性土样中的优势菌群,其中酸杆菌门在该生态系统中占有绝对优势。变形菌菌群中的主要类群为光合细菌,固氮细菌和溶菌细菌。研究表明,在木质纤维素自然降解的过程中,存在于酸性树洞土壤中的细菌参与了碳素和氮素的固定与循环,并对其微生态的稳定起到重要作用。

类球红细菌产辅酶Q_(10)发酵工艺的优化

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一类高产辅酶Q10的光合细菌,该研究对R.sphaeroides EIM-8产辅酶Q10的发酵条件和培养基进行了优化。采用单因素结合响应面设计优化后的培养基组成为:葡萄糖27.8 g/L、(NH4)2SO4 4.9 g/L、谷氨酸4.7 g/L、玉米浆粉2.5 g/L、MgSO49.5 g/L、FeSO41.5 g/L,NaCl 3.5 g/L,KH2PO44.0 g/L、辅液15.0 mL/L;通过单因素试验方法确定的培养条件为:pH 6.5、温度32℃、接种量10%、装液量40mL/250 mL,此条件下辅酶Q10产量可达128.9 mg/L,比优化前提高了89.0%。

灰黄霉素高产变株与出发菌株18S rRNA基因序列的比较分析

根据真菌18S rDNA的保守序列设计引物,对灰黄霉素高产突变菌Penicillium griseofulvum F208与出发菌株Penicillium griseofulvum 3.5190的18S rRNA进行克隆测序及对比分析,并登录GenBank(序列号为EF608151和EF607282).依据18S rDNA建立的系统进化树表明突变株F208与出发菌株3.5190的遗传距离较远,而与Penicillium urticae亲缘关系最近.出发菌株3.5190与Penicillium commune亲缘关系最近.18SrDNA作为分子标记可有效地鉴别灰黄霉素产生菌(Penicillium griseofulvum)高产与低产菌株.

宏基因组学在发现新基因方面的应用

现代分子微生物生态学研究表明,自然环境中约99%的微生物不能用传统的分离培养方法获得其纯培养,使得环境微生物中的多样性基因资源难以得到充分的开发和应用。宏基因组学是近年来发展起来的,通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组DNA并克隆到合适的可培养微生物宿主中,来筛选目的基因的方法。它已在微生物新功能基因筛选、活性物质开发和微生物多样性研究等方面取得了显著成果。该文旨在介绍宏基因组学在新功能基因发现方面的应用概况并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最近研究进展进行简要综述。

辅酶Q10的生物合成及其高表达研究进展

辅酶Q10(CoQ10)不仅是呼吸链上的电子传递体,同时也具有抗氧化功能。目前全球市场上的CoQ10正处于一种供不应求的状态。我们简要论述了CoQ10的结构、性质、功能及其生物合成过程,同时概括总结了现阶段为提高CoQ10产量而采用的新型技术手段。

中性纤维素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的异源表达

利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因(CBHⅡ)全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达。gel pro Analyser软件分析其表达蛋白的表观分子量约为62.548ku。用BandScan软件分析其蛋白表达量为2.3%,即0.738μg/mL(mg/L)。

生物类研究生对实验室生物安全认知情况的调查分析

通过对高校生物类研究生进行自填式问卷调查,了解其对生物实验室安全知识的认知情况。调查显示他们对生物安全的认识存在有诸多不足,同时学校在系统化安全教育方面的工作还有待提高。基于此,建议高校从加强实验室安全设施建设、建立健全安全管理制度、定期开展实验室安全教育、切实发挥导师的指导作用、培养学生良好的科研工作习惯以及利用现代化技术进一步保障实验室的安全等方面,提高学生对实验室生物安全的认知,以期达到加强实验室生物安全管理的目的。

1,4-苯醌抑菌作用的测定方法及其抑菌效果的研究

目的研究1,4-苯醌抑菌作用的测定方法及其抑菌效果。方法应用平板法、牛津杯法、熏蒸法和涂布法,研究了1,4-苯醌对细菌、酵母菌和霉菌中的各一种菌的抑菌作用,并采用平板连续稀释法研究了它对这三类6种菌的最小抑菌浓度。结果在4种方法中1,4-苯醌用对供试菌均有抑制作用,平板法效果最好,涂布法较差。当浓度分别为125,250或500mg·L-1时,1,4-苯醌对不同供试菌能完全抑制。结论平板法的抗菌剂用量大,适于测最小抑菌浓度,牛津杯法适于抗菌剂的量较少时的抑菌试验,熏蒸法适于挥发性溶剂提取抑菌物质的抑菌试验。1,4-苯醌是广谱的抗菌剂。

线虫surface coat proteins提取方法的建立与双向电泳分析

目的:建立一套适用于蛋白质双向电泳体系的线虫surface coat proteins(SCPs)样品制备技术,为今后研究线虫surfacecoat蛋白质组学及线虫病理生理学奠定基础。方法:以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为研究材料,对比和分析不同的蛋白提取沉淀方法,进而采用SDS-PAGE电泳技术和双向电泳技术对所提蛋白进行评价。结果:通过35%乙醇结合TCA-丙酮沉淀法获得的质量较好的线虫SCPs,在12%的SDS-PAGE分析中该法提取的蛋白背景浅,蛋白条带多且清晰尖锐,含有丰富的蛋白信息量。通过双向电泳分析,可从提取的蛋白中鉴定出清晰蛋白点400多个。随机选择5个蛋白斑点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,鉴定得到高度匹配的已知线虫蛋白质2个。结论:所建立的方法可为今后研究线虫surface coat蛋白质组学及线虫病理生理学提供重要工具。

线虫生防细菌W3对线虫侵染活性的测定

目的:筛选以体壁穿透方式进入线虫体内而引起宿主致病的杀线虫细菌,为开发新的植物寄生线虫生防战略奠定基础。方法:通过毒性测试和平板法筛选杀线虫细菌,利用显微镜和扫描电镜研究观察细菌对线虫的作用方式和侵染过程。结果:筛选获得的杀线虫细菌菌株W3具有明显的侵染活性。生测结果表明,细菌培养上清液和上清蛋白粗提物对腐生线虫致死率分别达到95%和100%。在平板测试中,测试线虫体壁被严重破坏,在48h内超过80%的线虫被杀死和降解。扫描电镜观察可以明显的看到细菌穿透线虫体壁后在线虫体壁上留下的孔。结论:细菌W3具有显著的杀线虫活性和线虫体壁降解活性,其杀线虫活性物质主要存在于细菌培养上清液中。

木聚糖酶高产菌株EIM-30的鉴定及其产酶条件的优化

通过对木聚糖酶高产菌株EIM-30基于形态学和18SrDNA序列的系统发育进化分析，鉴定为里氏木霉Trichoder撇reesei。在单因子实验确定EIM-30产木聚糖酶的最适碳源和氮源的基础上，通过Plackett—Burman实验对影响其产酶的相关因素进行评估并筛选出3个显著效应因子，然后应用最陡爬坡实验和响应面分析确定最适产酶培养基配方为：酵母浸膏1．50％，蛋白胨1．00％，NaC10．50％，PPG-20000．10％，MgS041．20％，CaC20．18％，（NH4）2S040．45％，甘油4．18％，乳糖3．05％，K2唧041．59％。优化后TrichodermareeseiEIM-30的液体发酵产木聚糖酶的活力可达9．857×105V／mL，较优化前提高1．98倍。

杀线虫细菌W3胞外体壁降解蛋白酶的纯化及部分特性

[目的]为筛选和开发高效新型生物杀线虫剂提供依据。[方法]以土壤中筛选的1株具有明显杀线虫活性的细菌菌株W3为供试菌种,对其进行发酵培养,采用硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子柱层析等方法从发酵液中分离W3菌株的杀线虫活性成分,并对各活性成分的杀线虫活性进行测定。[结果]W3菌株粗蛋白处理线虫4 h后,虫体活动异常,部分虫体静止不动,处理36 h后大部分虫体不活动,部分虫体体壁断裂现象,最终所有线虫被完全消解;从发酵液中纯化出1种能降解线虫体壁的胞外蛋白酶,该酶的分子量约为45KDa,其作用的最佳pH值为7～8,最佳温度为45℃。[结论]W3菌株胞外蛋白酶具有明显的杀线虫活性和线虫体壁降解活性。

酿酒酵母SNF4基因的克隆及生物信息学分析

SNF4基因编码的Snf4p具有调节Snf1复合体的蛋白激酶活性功能,根据已知的SNF4基因序列设计引物扩增获得S.cerevisiae YS2的SNF4基因完整序列。序列分析表明,SNF4基因的开放阅读框为969bp,编码322个氨基酸残基。应用生物信息方法预测其理化性质、疏水性、信号肽、亚细胞定位、活性位点及其高级结构。结果表明:Snf4p为具有一定亲水性的非跨膜胞内稳定酸性蛋白,功能结构域为CBS_pair superfamily结构域,二级结构主要由a-螺旋组成,空间结构是由4个CBS结构域构成两个CBS对围绕形成的二聚体。Snf4p的第一个CBS对区域的β片层结构是Snf1p、Sip2p的β发夹结构结合作用区。

辅酶Q_(10)菌种选育及高通量筛选研究进展

辅酶Q10在预防和治疗人体疾病上起到非常重要的作用,广泛应用于化妆品和保健品领域,其市场需求和工业产量均持续扩大。微生物发酵法制备辅酶Q10是目前最经济且有前景的方法,而选育获得高产菌株是微生物发酵生产的关键。通常,采用传统或现代遗传改造技术处理菌株,产生大量突变后代,然后从中筛选出增幅最大的高产菌株。由于微生物突变是随机不定向的,因此高通量的筛选技术是实现突变库快速高效筛选和提高育种效率的保障。综述了近年来国内外在辅酶Q10高产菌株选育方面的技术和原理进展,以及显色定量法、紫外薄层色谱、HPLC,UPLC等技术在其高通量筛选方面的应用等相关研究进展。