广东省伤寒沙门菌株的脉冲场凝胶电泳分型研究

目的运用脉冲场凝胶(PFGE)电泳研究广东省伤寒沙门菌的分子流行病学。方法用PFGE对菌株进行分子分型,所得结果用Bionumerisc V4．0软件进行聚类分析。结果来自广东省6个地区的51株伤寒沙门菌,根据电泳图谱分析,可分为45个PFGE型别,菌株间的相似值在38．27％～100．00％,6个地区间没有同源的菌株,同一个地区不同年份也没有同源的菌株,而同一地区同一年份可出现同源的菌株。结论PFGE是一种敏感的研究伤寒沙门菌分子流行病学的基因分型方法。

广东省福氏志贺菌毒力基因的研究

目的对2004年广东省4个不同地区分离的35株福氏志贺菌进行毒力基因的检测,以了解其毒力基因的携带情况。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法,以志贺肠毒素1(ShET-1)基因set1、志贺肠毒素2(ShET-2)基因sen、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)和侵袭相关位点基因(ial)为靶基因进行检测,并用set1和sen对其进行基因分型。结果35株福氏志贺菌中,有33株(94.29%)为ShET-1阳性,34株(97.14%)为ShET-2阳性,所有菌株的ipaH基因均为阳性,只有20株(57.14%)的ial基因为阳性。35株菌共分3种基因型:1株为set1(-)/sen(-),1株为set1(+)/sen(-),33株为set1(+)/sen(+)。结论广东省的福氏志贺菌的ShET-1和ShET-2携带率非常高,set1(+)/sen(+)为优势基因型。

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

目的掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。方法选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析。结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+、cps2J+/mrp+/sly-/gdh+/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/ef+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef-为病猪菌株所特有;MLST分型结果显示,22株分为ST1、ST7和ST28三个型别,其中ST1、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有。结论广东地区病人、病猪的猪链球菌2型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据。

广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究

以广东省内5个罗非鱼Oreochromis niloticus主要养殖区内分离的无乳链球菌Streptococcus agalactiae为研究目标,通过毒力基因PCR检测、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳技术研究广东地区感染罗非鱼的无乳链球菌分子特征。结果发现170株分离无乳链球菌中毒力基因的携带率介于60.59%~100%之间,毒力基因携带形成10个谱系,dltR-bca-sod A-spb1-cfb-bac（38.24%,65/170）,dltr-bca-sod A-spb1-bac（23.53%,40/170）和dltr-bca-sod A-spb1-cfb-bac-scp B（22,35%,38/170）为主要的谱系,dltr-bca-sod A-spb1-bac-scpb（8.24%,14/170）和dltr-bca-sod A-spb1（4.71%,8/170）次之。多位点序列分型研究证实170株菌在7个位点均为单一的等位基因,为adh P（10）,phe S（1）,atr（2）,gln A（1）,sdh A（3）,glc K（2）,tkt（2）,序列型为ST7型。146株菌脉冲场凝胶电泳结果表明146株菌分为6个簇（A-D,F,G）,相似性介于86%~100%之间。A（18）,B（16）,C（103）,D（7）为主要的遗传簇,占菌株数的98.63%（144/146）。基因簇A,C在4个采样区均有发现;基因簇B分布在吴川、茂名和阳江;基因簇D分布在茂名、珠海和阳江;基因簇F和G分别来自茂名和珠海。在A-D遗传簇中均有发现来自不同地区的菌株呈现100%的相似性,为同一克隆株。结果表明广东省主要罗非鱼养殖区内感染链球菌携带毒力基因比率高,序列型均为高致病的ST7型别,不同地区间具有相同的PFGE型别,不同地区间交叉传播感染的可能高。

2005年广东省临床分离猪链球菌的MLST分子分型研究

在2005年四川发生猪链球菌人间感染疫情期间,广东省也加强了监测,并发现了5个散发感染病例。从这5个住院临床病例中,分别分离了5个致病性SS2。通过测定猪链球菌基因组上的7个看家基因dpr、thrA、cpn60、recA、gki、aroA和mutS的部分片段,对这5个猪链球菌进行了多位点测序分型。通过对上述测序片段进行比对分析发现,5个菌株的dpr、cpn60、recA、gki、aroA和mutS等6个基因片段完全相同;而thrA基因片段存在两个等位基因型即thrA-c和thrA-h,在该等位基因片段的360位的亮氨酸密码子第三位发生了一个中性突变(TTA→TTG)。MLST分析结果显示,广东省的临床猪链球菌分离株L-SS002、L-SS003和L-SS005菌株,与四川疫情株相同,属于ST7型;而L-SS004和L-SS006,与香港地区发现的猪链球菌相同,属于ST1克隆;但这5个菌株亲缘关系极近,都属于ST1克隆复合物;这一点与四川省暴发的人间猪链疫情明显不同,后者仅由单一的ST7猪链球菌克隆引起。属于ST7的克隆菌株很可能来源于四川;而其余两个ST1克隆系菌株的来源尚待鉴定。

2010—2013年广州市食源性疾病监测副溶血性弧菌的病原学特征

目的 了解2010—2013年广州市食源性疾病监测副溶血性弧菌分离株的血清型别、抗菌药物耐药性、毒力基因携带情况以及分子分型特征。方法 对广州市2010—2013年食源性疾病监测中分离到的108株副溶血性弧菌进行血清分型、药敏试验以及耐热直接溶血毒素基因（tdh）、耐热相关溶血毒素基因（trh）的PCR检测,并进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型。结果 2010—2013年广州市副溶血性弧菌的主要血清型为O3：K6（51株,47.2%）、O1：KUT（32株,29.6%）。药敏检测结果显示,分离株对氨苄西林（90.7%）和头孢吡肟（28.8%）耐药率较高,而对复方新诺明、氯霉素则100.0%敏感。多重耐药分析显示,2010—2013年分别有53.6%（15/28）、20.6%（7/34）、18.8%（3/16）、33.3%（10/30）的分离株同时耐受≥3种抗菌药物。毒力基因PCR检测显示,95.4%（103/108）的分离株为tdh＋trh-,4.6%（5/108）的分离株为tdh-trh＋。PFGE显示,108株副溶血性弧菌经NotⅠ酶切后的PFGE图谱可分为3个聚类,55个PFGE型别,相似值为60.2%~100%。优势血清型O3：K6和O1：KUT主要集中于聚类Ⅱ,O4：K8血清型主要集中于聚类Ⅲ。结论 2010—2013年广州市食源性疾病监测副溶血性弧菌优势血清型为O3：K6和O1：KUT型,菌株对多数抗菌药物仍然比较敏感,但存在多重耐药现象,多数菌株携带tdh基因,PFGE结果提示广州市食源性监测副溶血性弧菌存在遗传多样性。

广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析

目的了解广东省布鲁氏菌分离株的分子特征。方法应用传统分型鉴定方法和PCR扩增布鲁氏菌属特异性基因BCSP31,对广东省历年布鲁氏菌分离株作鉴定分型,进一步采用脉冲场电泳技术(PFGE)进行分子分型,分析比较菌株分子指纹图谱的相似性,以探讨不同年份和地域菌株之间的相关性。结果1965年广东省布鲁氏菌分离株以羊种和猪种为主,1985年的分离株均为猪种3型,2006和2007年的分离株均为羊种3型;PFGE电泳图谱经聚类分析结果显示,历年布鲁氏菌分离株分成三大簇(Clusters):1965年羊种、1965年猪种与1985年猪种3型、2006年和2007年羊种3型。近两年珠三角地区布鲁氏菌病的流行优势菌型为羊种3型,且同源性达100%,但与1965年羊种分离株的同源性只有77.7%。结论近两年我省布鲁氏菌的优势菌型为羊种3型,各地区分离株之间的遗传关系高度相关,与20年前的分离株同源性差。PFGE可作为传统生物分型的补充手段,可在种的水平对布鲁氏菌分离株分型。

广东省布鲁氏菌病病原学特征分析

目的从表型和分子生物学水平鉴定广东省2005-2006年分离的布鲁氏菌菌株,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法分析与省内及既往菌株的同源性。方法运用常规方法鉴定了6株布鲁氏菌菌株,进一步用BCSP31-PCR技术和PFGE方法进行种的水平区分及同源性分析。结果6株菌均为羊种3型,属特异性基因BCSP31阳性,菌株间的PFGE分型相似值介于69.2%～100%。结论广东省这2年分离的布鲁氏菌菌株均为羊种3型,与1985年比较发生了种的改变,PFGE方法可在种的水平区分布鲁氏菌的3个种。

广东省布鲁氏菌菌株脂肪酸成分分析

目的探讨脂肪酸成分分析方法对广东布鲁氏菌菌株进行分型的可能性,获得广东布鲁氏菌脂肪酸成分的本底资料。方法选择历年从广东不同地区分离到的29株布鲁氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析,利用MIDI公司Sherlock系统的软件进行聚类分析。结果广东布鲁氏菌的主要脂肪酸成分为19:0cycloω8c酸、16:0酸、18:0酸,其中牛种菌的19:0cycloω8c酸含量最高,羊种次之,猪种最低,其中羊种和猪种布鲁氏菌19:0cycloω8c酸、18:0酸含量差异有统计学意义,1965年和近3年的羊种布鲁氏菌株19:0cycloω8c酸、18:0酸含量差异有统计学意义。结论菌株的脂肪酸成分稳定,但各种间脂肪酸含量存在差异,一定的欧氏距离时,可以在种的水平上区分布鲁氏菌的3个种。

16S rDNA测序鉴定β溶血性G群链球菌

目的对一起群聚性儿童肾小球肾炎暴发事件中分离到的26株β溶血性G群链球菌进行16SrDNA测序鉴定,探讨该方法在病原学鉴定方面的意义。方法分别采用API20 Strep生化鉴定系统、部分和全序列测定16S rDNA鉴定26株β溶血性G群链球菌;使用MegaV3.1软件,采用Neighbour-joining方法和boot-strap test对部分菌株的全序列进行树状图分析。结果API20 Strep生化鉴定率低,未能鉴定出目的菌;采用16S rDNA测序,结果均为咽峡炎链球菌(S.anginosus),鉴定率大于97%。其中4株G群的全序列树状图分析显示,G群链球菌均与咽峡炎链球菌聚类在同一簇。结论16S rDNA序列鉴定能提供详细明确的核苷酸信息,能区分G群链球菌不同的种,显示其在菌株鉴定方面的独特优势。

华南地区常见的8种食源性致病菌检测基因芯片研制

目的研制能同时检测华南地区常见8种食源性致病菌的oligo基因芯片。针对8种食源性致病菌基因组上的特征性靶区域,设计70mer的寡核苷酸探针。方法分别以检测8种食源性致病菌中每一种菌的检测探针组构建一个亚阵列;然后再将上述的8个亚阵列构建为一个大阵列,并命名为Biosafood-8芯片。用Biosafood-8芯片检测18个种属样品后进行PPR的排序与比较。结果 LM亚阵列检测李斯特菌属的3个李斯特菌LM、Lin和Liv的PPR分别为68.8%、51.8%和59.6%,而其它非李斯特菌属样品的PPR都在43%以下;VC亚阵列检测VC样品的PPR为54.1%,而其它非VC样品的PPR都在17.2%以下;VP亚阵列检测VP样品为66.7%,而其它非VP样品都在24.2%以下;Sal亚阵列检测Sal样品为55.9%,而其它非Sal样品都在50.5%以下;Shi亚阵列检测Shi样品为53.8%,而其它非Shi样品都在36.6%以下;SA亚阵列检测SA样品为65.2%,而其它非SA样品都在22.7%以下;CJ亚阵列检测CJ和CC分别为88.2%和58.8%,而其它非弯曲菌样品都在35.3%以下;EC亚阵列检测EC样品为47.9%,而其它非EC样品都在41.6%以下。结论用Biosafood-8芯片检测18个不同种属来源的已知参考生物样品,从全阵列和芯片上每一个亚阵列两个不同的水平,都证实该芯片能够通过集成的8个目标菌检测探针亚阵列,在整体芯片阵列水平,清晰而又明确地区分目标致病菌样品和非目标致病菌样品,特异而又准确地显示被检测样品的目标菌种属。

广东省2004年流脑监测结果分析

目的了解广东省流脑流行特征的变化,预测流脑发病的趋势,为合理地制定有效的预防措施提供依据. 方法2004年对全省各县、市进行流脑流行病学监测.选择广州、湛江、韶关及东莞4个市作为流脑重点监测点,在流脑流行前期(10～11月)各监测点按流脑监测方案采集市内0～、5～、10～、15～、25～、35～及45岁以上共7个年龄组人群的咽拭子进行健康人群带菌调查.同时对2004年广东省发生的一起流脑局部暴发疫情进行深入调查. 结果2004年4个监测点健康人群脑膜炎奈瑟菌(简称Nm)的带菌率为0.75%(14/1 876),健康人带菌以B群Nm为主.全省共报告流脑27例,死亡1例.2004年3月广东省发生一起由C群Nm引起的暴发疫情,共发病3例,调查发现患者密切接触者、发病分厂的外来工及相邻厂外来工总的Nm带菌率高达13.1%(14/107),检出B群、C群及1892群Nm,未检出A群Nm.用Epsilometer test法对所分离到的15株各群Nm菌株进行药物敏感试验,发现所有菌株均对青霉素及氯霉素敏感,对甲氧苄氨耐药. 结论广东省流脑发病以散发为主,健康人群Nm的带菌率很低,但流行菌群发生变化.今后要加强流脑的病原学检测,并适当对流脑预防控制措施作相应调整,一旦发生C群流脑疫情,应对重点人群应急接种A+C流脑多糖疫苗,对密切接触者选择敏感的药物进行预防性服药.

2001-2003年广东省钩端螺旋体病监测结果分析

[目的]通过监测,了解广东省人群及宿主动物中钩体病菌群的变化,为预防钩体病的爆发流行,合理有效地制定预防措施。[方法]采集相关人群及宿主动物血清用显微镜凝集试验(MAT)进行抗体测定;采集相关人群全血、宿主动物脏器做钩端螺旋体分离培养及分群鉴定。[结果]健康人血清、疑似病人血清、宿主动物血清平均抗体阳性率分别为33.90%、4.59%、36.69%;在疑似病人血中分离培养出秋季热群钩体1株;在鼠肾中分离培养出21株钩端螺旋体,其中爪哇群14株、秋季热群4株、黄疸出血群2株和澳洲群1株;在猪肾、蛙肾中均未分离到钩端螺旋体。[结论]广东省人群及宿主动物钩体隐性感染水平较高,人群中血清抗体阳性的菌型以黄疸出血群为多,而宿主动物以爪哇群为多。鼠类动物脏器分离培养及血清抗体阳性率较高,显示老鼠仍然是传播钩体的主要传染源之一,提示我们要警惕由于菌群的更迭而引起钩体病的爆发流行。

广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的:了解广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法:采用免疫磁珠富集法进行O157:H7大肠杆菌分离,对O157:H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后,应用PCR技术检测其毒力因子,应用纸片法(K-B法)进行药敏试验。结果:从277份样品中分离出2株O157:H7大肠杆菌,总检出率为0.72%;对这2株O157:H7大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定,其中1株为携带eaeA、H ly和SLT2毒力因子的强毒株,而另1株分离株未检出毒力因子。药敏试验结果显示,这两个O157:H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性。结论:广东省食品中存在O157:H7大肠杆菌强毒株的污染。O157:H7大肠杆菌多重耐药株的出现,提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况。

钙结合蛋白D-9K基因原核表达载体的构建、表达产物纯化及其多克隆抗体的制备

本研究构建了pBV220/CabpD-9k-βhCG表达质粒,在大肠杆菌TG-1中进行表达,得到了CabpD-9k-βhCG融合蛋白。SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为34.5KD。West-ern blot结果表明,融合蛋白与兔抗人hCGIgG特异结合。用纯化的融合蛋白免疫C57BL小鼠,制备了多克隆抗体,这为进一步研究钙结 合蛋白D-9k在着床中的功能和子宫内膜Ca^(2+)信号转导奠定了基础。

珠江河口水体霍乱弧菌污染状况调查研究

目的：了解珠江河口水体O1/O139群霍乱弧菌的污染情况,提出改善水体霍乱弧菌监测的建议,为采取针对性措施预防控制霍乱的发生和流行提供依据。方法：根据历年霍乱监测资料和疫点分布状况,在珠江水系广州段选择设立24个采样点,每月采集水体标本进行O1/O139群霍乱弧菌分离培养,对分离得到的阳性菌株进行血清分型、噬菌体-生物分型、PCR检测毒力基因、K-B法药敏试验。结果：2006年3月-2007年2月共采取862份水体样本,其中有67份检出O1或O139群霍乱弧菌,检出率为7.77%,血清型以O1群为主,尤以稻叶型占优;O1群菌株均为非流行株,2株O139群菌株检出ctx毒力基因;菌株耐药分析发现不同血清型菌株耐药谱有所差异。结论：O1/O139群霍乱弧菌在珠江河口水体环境中广泛存在,常年均可从水体中分离获得。必须加强环境水体及海水产品霍乱弧菌监测,及时了解其污染状况,以便采取针对性措施预防控制霍乱的发生和流行。

广东省流行性脑脊髓膜炎流行菌群变化趋势分析

目的研究流行性脑脊髓膜炎（流脑）流行菌群的变迁趋势。方法对广东省1966—2009年分离的656株流脑菌株的血清群构成进行分析。结果656株流脑菌株中，A群占24％、B群占47％、C群占9％，其它群占20％。1966—2001年的447株流脑菌株中，A群占22％、B群占46％、C群占6％，其它群占26％；2002—2009年的209株流脑菌株中，A群占28％、B群占53％、c群占13％，其它群占6％。A群流脑病人来源菌株比例由85％下降至47％，B群流脑病人来源菌株比例由15％上升至28％，c群流脑病人来源菌株比例由0％上升至22％。健康人群鼻咽部携带C群流脑菌株的比例由7％上升至11％，A群由9％上升至24％，B群由53％上升至58％。结论广东省流脑病人及健康人群携带菌株中，C群、B群流脑菌株的比例呈上升趋势，流脑流行菌群正在发生从A群到C群、B群的变化。

MLST分型技术应用于脑膜炎奈瑟菌的分子流行病学研究

目的对广东省1967-2007年自流行性脑脊髓膜炎(流脑)病人中分离的脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis,N.meningitidis)进行分子流行病学研究,了解菌株间的遗传进化关系。方法采用多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)技术,分别对1967-2007年分离的16株N.meningitidis菌株的7个看家基因的序列进行测定,并将序列与PubMLST数据库中储存的序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(Sequencetype,ST),并采用Splits Tree在线软件分析菌株之间的进化关系。结果16株N.meningitidis菌株分为13株A群、2株C群和1株W135群,分属5大克隆系,分别为ST-5、ST-1、ST-4821、ST-11克隆系和未知克隆系的ST-254序列型,其中ST-5克隆系所占比例最多,占68.75%(11/16)。1967-2006年的13株A群分离株中,11株属ST-5克隆系,占84.61%(11/13),另有1977年的1株分离株为ST-1克隆系和1株1984年的分离株为未知克隆系的ST-254序列型;2004和2006年的C群分离株属新出现的高致病性克隆系ST-4821;2007年首次分离的1株W135群菌株为ST-2960,属高致病性的ST-11/ET-37克隆系的子克隆。结论分离于不同年代病人的广东N.meningitidis分离株呈多克隆系并存,但近期以高致病性克隆系为主,特别是广东省首次出现高致病性ST-11/ET-37克隆系的W135群,提示应加强流脑的病原学监测。应用MLST分子分型技术,初步揭示了广东省脑膜炎奈瑟菌的遗传进化关系,基于等位基因图谱的MLST基因分型技术具有较高的分辨率,并通过互联网实现了序列数据库信息的全球共享。

两种技术在广东地区布鲁氏菌菌株分型中的应用与评价

目的：对脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）两种分子分型方法在布鲁氏菌分型研究中的应用进行比较和评价。方法采用PFGE和MLVA分子分型方法对60株布鲁氏菌地方株和3株标准菌株（16M、544A、1330S）进行分型比较。结果63株菌株间PFGE相似性系数介于72．1％～100％，在94．4％相似水平可区分羊、猪、牛3个种，在100．0％相似水平上可分为14个群29种PFGE型别，分辨力为0．9575；MLVA相似性系数介于16．9％～100％，在52．3％相似水平可区分羊、猪、牛3个种，在100．0％相似水平上可分为8个群47种MLVA型别，分辨力为0．9852。结论PFGE和MLVA均可在一定的相似系数从种的水平区分羊、猪、牛3个种，但不能区分同种异型；两种方法均可用于布鲁氏菌的分子分型，MLVA较PFGE具有稍高的分辨能力。