柑桔黄龙病病原物提纯方法和血清学的初步研究

从感染柑桔黄龙病的长春花中,用0.1mol/L MgCl_2—0.5mol/L甘露醇-0.6mol/L甘氨酸的混合溶液作黄龙病病原物(YSO yellow sbootO rgancism)分离溶液(pH7.4),然后用纤维素酶酶解法和差速离心相结合的提纯程序,反复试验结果表明该提纯方法重复性稳定,黄龙病病原物(YSO)的提纯产量较高,完整性较好,内外结构清晰。用提纯液备制小鼠腹水抗体,得到微量沉淀反应效价为1:640,环状界凝集反应效性为1:8,免疫电镜效价1:320,琼脂双扩散反应阴性,对照为阴性反应,从而认为YSO具有特异抗原性。

应用多聚酶链式反应（PCR）技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原

应用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术对柑桔黄龙病病原进行检测和定量分析。研究结果表明：ＰＣＲ技术能准确、快速地检测出田间和温室内罹病的柑桔、长春花以及带菌柑桔木虱样本中的柑桔黄龙病病原（ＢＬＯ），而健康植株和柑桔木虱样本则呈阴性反应。采用的ＰＣＲ引物（Ｐｒｉｍｅｒｓ）是根据柑桔黄龙病病原亚洲株系的ＤＮＡ序列（Ｉｎ－２．６，基因库号码：Ｍ９４９１）设计的。应用竞争性定量多聚酶链式反应（Ｑ－ＰＣＲ）方法能测定病原在不同样品中的含量。该技术关键在于：病原ＤＮＡ和浓度系列稀释后的竞争物ＤＮＡ，在同一试管中进行ＤＮＡ扩增反应时，共用相同的引物。由于彼此互相竞争反应引物的结果，病原的ＰＣＲ产物和竞争物的ＰＣＲ产物在数量上呈反向线性相关。因竞争物的浓度为已知，便可从线性关系中推算出病原的含量。

应用电镜与PCR技术检测琯溪蜜柚黄龙病病原

福建省产区发生琯溪蜜柚叶片斑驳、果实变小及全株矮化的病树是柑桔黄龙病引起的。采用电镜技术与 PCR技术研究 ,证明其病原 BL O在形态、大小与构造上和柑桔黄龙病病原 (BL O)相同 ,其病原 DNA、PCR扩增及 Southern Blot分子杂交的结果 ,证明它与柑桔黄龙病病原 PCR的产物具有很高的同源性。本病具有传染性 ,能通过病梢嫁接传染给琯溪蜜柚的健苗。

柑桔黄龙病诊断法的研究进展

研究柑桔黄龙病的困难，在于它的病原无法人工培养。因此，长期以来对黄龙病的诊断，主要依据典型的黄梢和叶片斑驳症状。在柑桔园管理不良，缺乏营养或其它病虫混合为害时，便难依据症状作出正确的诊断。这是造成对黄龙病认识上种种混淆的主要原因。７０年代应用电镜观察到黄龙病病原（ＢＬＯ）之后，电镜便成为诊断黄龙病的重要手段。但因病原在病树体内的浓度较低，分布又不均匀，致电镜的检出率偏低。８０年代，应用兔丝子将黄龙病ＢＬＯ转到长春花上增殖、提纯，作为抗原，制备了多抗和单抗的血清，由于多抗血清的效价很低和单抗血清的专化性太狭，均难用于诊断。最近，在病原ＤＮＡ序列测定的基础上，合成了引物Ｐ１及Ｐ２，并在引物Ｐ１及Ｐ２之间合成另一段ＤＮＡ片段Ｐ３作为探针。使ＰＣＲ（多聚酶链式反应）及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术可能用于黄龙病的诊断。研究结果证明ＰＣＲ技术比其他方法具有更大优点，能快速而准确地检测出病原；而Ｑ－ＰＣＲ（竞争性定量多聚酶链式反应）方法则能测定病原在不同样品中的含量，进行定量分析。

琯溪蜜柚黄龙病病原的克隆及序列分析

溪蜜柚是中国大陆柚类中的优质品种。近年来 ,在福建省的产地发现溪蜜柚叶片表现斑驳的病树 ,其叶片斑驳与柑桔黄龙病的叶片病状十分相似。据实验结果证明 :该病能通过病梢嫁接传染到柚和柑桔的健苗 ;在电镜下观察到病株韧皮部寄生着大量 BL Os,其形态和构造均与柑桔黄龙病病原 (L iberobacter asiaticum)相似 ;经PCR扩增与 Southern Blot分子杂交测定 ,表明该病原 DNA PCR产物与柑桔黄龙病病原 PCR产物之间具有很高的同源性。初步认为该病很可能是柑桔黄龙病引起的。为了进一步明确该病与柑桔黄龙病的关系 ,对病原 DNA片段进行扩增、克隆和序列分析 ,并与柑桔黄龙病病原基因相应序列进行比较 ,结果表明该病原与亚洲柑桔黄龙病病原 (L.asiaticum)相应基因序列的同源率达 94 .2 % ,而与非洲柑桔黄龙病病原 (L.africanum)的同源率仅为75 .0 %。进一步证明溪蜜柚叶片斑驳是柑桔黄龙病引起的 ,其病原是 L.

柚类果树叶片斑驳病的病原鉴定与检测

柚类是柑桔中的一类重要品种，在我国有广泛的分布。近年来，在福建等产区发现柚类病树日趋增多，其病状为叶片斑驳、小果、植株矮化，暂称为叶片斑驳病。本病能通过组织嫁接从病柚树传染到柚健苗和芦柑健苗。在电镜下观察，其病原菌体的形态和细胞壁构造与柑桔黄龙病的病原（Ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｉａｔｉｃｕｍ）十分相似。应用柑桔黄龙病病原ＤＮＡ的特异性引物进行ＰＣＲ试验产生的ＰＣＲ产物，其分子量与柑桔黄龙病病原ＤＮＡＰＣＲ产物的基本相同，为５６３ｂｐ．；以及应用柑桔黄龙病病原的特异性探针与其ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交试验，能产生杂交反应；这些都表明在柚树病原ＤＮＡ与柑桔黄龙病病原ＤＮＡ之间存在着十分高度的同源性。综上结果证明：柚类叶片斑驳的病原很可能与柑桔黄龙病病原是相同的，或其关系是十分密切的。

柑桔黄龙病病原形态与性质的研究

柑桔黄龙病病原体为多形态的,圆形的直径为50—500nm,杆状的大小为40—170×200—2500nm,其外界包被的平均厚度为25nm,外层为电子密度浓的暗色层,相似于细胞壁构造,厚度为7—10nm;内层为电子密度浓的暗色层,相似于细胞膜构造,厚度为3—8nm;中间层为电子密度稀的透明层,相似于周质空间,厚度为7—15nm.不论外层细胞壁或内层细胞膜,均由二层质膜构成.经木瓜蛋白酶处理后,在病原体包被的外壁与内膜间的透明层中,可以观察到一层电子密度浓的暗色层,厚度为5—8nm,十分相似于大肠杆菌的细胞壁的外膜与质膜间的肽聚糖层.因此,柑桔黄龙病病原很可能是一种革兰氏阴性的细菌.各种柑桔栽培品种筛管细胞内病原菌体的含量与它们感病性间可能有一定联系.