乏氧诱导因子-1与肿瘤乏氧的研究进展

乏氧是实体肿瘤发展过程中的普遍现象,它能诱导肿瘤细胞发生一系列基因表达的改变以适应环境。乏氧诱导 因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是其调控核心。一方面,HIF-1通过与靶基因启动子序列中的HRE结合调控其表达, 增加肿瘤新血管和红细胞生成、改变能量代谢途径等,以增加氧的利用率、减少氧的消耗,同时通过调控细胞周期调节蛋白、 凋亡相关基因的表达改变细胞周期、抑制细胞凋亡;另一方面,HIF-1的表达受多种基因产物的调控,如VHL,PTEN等。HIF-1 有多种生物学功能,如促进红细胞生成、肿瘤血管形成、促进肿瘤的转移和侵袭等。通过药物或基因治疗的方式抑制HIF-1的 活性是治疗肿瘤的一种新途径。

乏氧诱导因子结构、表达及调控

乏氧诱导因子(HIF)是乏氧应答中起重要作用的转录因子,一直是乏氧研究的焦点.HIF由α亚基和β亚基组成,α亚基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,其中α亚基因诱导条件不同通过选择性剪接产生不同变体.β亚基包括ARNT、ARNT2和ARNT3.α与β亚基在乏氧等应激反应时形成二聚体HIF启动靶基因转录表达,参与多种细胞生物学功能的调控.目前为止,大多数的研究都集中于野生型HIF-1α,对它的结构、表达调控及其调控做了相对全面而清楚的了解.后来通过多种策略及方法,陆续发现并克隆出了除HIF-1α外的HIF各亚基.研究不再局限于HIF-1α,而是扩展至HIF整个系统,如相继发现的HIF-2α和HIF-3α亚基,以及它们的变体,对HIF-1α的研究也更深入了,但是关于HIF-1α的变体、HIF-2α、HIF-3α及β亚基的表达调控及功能还不明确,是未来研究的方向.本文全面介绍HIF的最新研究进展,阐述HIF各亚基的结构、表达调控及其靶基因的表达情况.

肿瘤乏氧耐药机制及对策

乏氧是实体肿瘤发生的普遍现象,它可通过多种途径引起肿瘤耐药。其机制分两类:氧分子减少的直接作用和低氧引起如细胞周期停滞、DNA 修复酶增加、耐药蛋白增加、微酸环境等的间接作用。针对肿瘤乏氧耐药的治疗主要有3种途径:提高肿瘤氧合、开发利用肿瘤乏氧微环境和以乏氧诱导因子-1(HIF-1) 为靶点的治疗。

质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用

目的研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果.方法构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3.将其与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达.结果 pLasRiGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97.5%、97%和89%,Hela细胞中为83%、90%和90%,SPCA1细胞中为65%、55%和40%.pLasRiGFP1与pLasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53%和58%.RNAi作用在48～96 h最强,并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势,但到达一定量后作用趋势平缓.结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi,其作用存在剂量和时间效应,受靶序列、细胞类型等因素的影响.

慢病毒shRNA表达载体介导人肿瘤细胞基因稳定沉默的影响因素

目的:探讨慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰的影响因素。方法:用介导RNAi的慢病毒载体Lenti6-HIF1α和Lenti6-HIF1β分别转导人肿瘤细胞系Hela、SPCA1和A549,筛选靶基因稳定表达沉默的细胞株。病毒RNA分子拷贝数和靶基因mRNA水平用实时定量RT-PCR确定。结果:针对不同靶基因的慢病毒转导肿瘤细胞的效率与靶基因无关、存在细胞类型特异性。8h内病毒转导效率与吸附时间呈正关,12h后继续延长吸附时间不能提高转导效率。对靶基因表达的特异性抑制效果与病毒量呈正相关。靶基因稳定沉默细胞株的RNAi效果与细胞类型无关,与靶细胞基因组整合的shRNA表达结构的拷贝数呈正相关。结论:慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰,短期基因抑制效果取决于细胞类型、病毒量和病毒的吸附时间,稳定基因沉默效果与病毒整合到靶细胞基因组的拷贝数相关,筛选稳定基因沉默细胞株时,应尽可能提高病毒量以提高病毒整合的拷贝数。

18种人肿瘤细胞株药物敏感性与基因表达的关系

目的探讨18种人肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与基因表达的关系。方法采用MTT法检测细胞株对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)和卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果不同细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析表明,细胞株对DDP的敏感性与p53表达呈负相关(P=0.041),对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关(P>0.05)。结论细胞株对DDP的敏感性与p53表达有关。

乏氧诱导因子-1α基因沉默对肺癌细胞乏氧应答相关基因表达的影响

乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)是肿瘤细胞适应乏氧微环境的关键调控因子,具有作为治疗靶基因的潜力,以克服乏氧诱导的治疗抗拒等效应.下调其表达可能影响肿瘤细胞内一系列乏氧应答相关基因的表达.本研究采用已构建的HIF-1αRNAi慢病毒载体转导肺腺癌A549细胞,经杀稻瘟素(blasticidin)筛选建立HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株.应用cDNA微阵列技术检测并比较HIF-1α基因沉默A549细胞株和其亲本细胞株在常氧和乏氧状态下的基因表达谱改变.应用定量RT-PCR方法验证部分cDNA芯片差异表达基因的表达改变.HIF-1α基因稳定沉默细胞株A549/HIF-1α(-),在常氧和乏氧条件下HIF-1α mRNA水平分别较A549细胞下降89.2%和88.1%,HIF-1α蛋白水平分别下降97.2%和88.4%.在乏氧条件下,cDNA微阵列检测的1280个基因中,52个基因表达上调,15个基因表达下调.HIF-1α基因沉默显著影响其中27个基因的乏氧诱导效应.定量RT-PCR验证其中ENO2、BCL-2、CXCR4和MMP11的表达水平,与cDNA芯片结果相符合.结果提示,HIF-1α基因沉默能够在一定程度上阻断肺癌细胞的乏氧应答,在克服乏氧导致的肺癌治疗抗拒方面具有潜力.

人乳腺癌细胞化疗敏感性与相关基因表达的关系

目的探讨人乳腺癌细胞化疗敏感性与多药耐药相关基因和凋亡调控基因表达的关系。方法MTT法检测5株人乳腺癌细胞株Bcap37、MCF-7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-435对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测多药耐药基因P-糖蛋白(P-GP)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和凋亡调控基因FAS、BCL-2、P53和P16的表达。结果不同人乳腺癌细胞株对同一药物敏感性差异较大。相关分析表明,细胞株对5-Fu的敏感性与P16表达呈正相关(P<0.01),对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关。结论人乳腺癌细胞株对5-Fu的敏感性与P16表达有关。

载体介导的哺乳动物细胞RNA干扰技术与基因治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物在进化过程中,抵御病毒感染及由重复序列和突变引起基因组不稳定 性的保护机制。RNAi是由双链RNA引发的靶基因mRNA降解而导致基因转录后沉默的现象,研究者利用这一现象对要研 究的基因进行抑制,从而形成了RNAi技术。RNAi具有特异高效的特点,因此该技术已在研究基因功能和进行基因治疗中得 到广泛应用。RNAi的实现途径有多种,每种方式都各有优缺点。

长期缺氧对肺腺癌 SPCA1细胞谷胱甘肽转移酶表达及耐药性的影响

目的探讨长期缺氧对 SPCA1细胞谷胱甘肽转移酶(GST-π)表达的影响及耐药性的改变。方法 SPCA1细胞常氧(20%O_2)和缺氧(0.5%O_2)条件下作用16 h 后,提取 RNA 和蛋白,用定量 RT-PCR 的方法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和GST-π mRNA 的表达情况,用 Western blotting法检测 HIF-1α蛋白;制备细胞悬液,用流式细胞仪测定 GST-π表达;通过克隆形成实验分析 SPCA1细胞对阿霉素和丝裂霉素的药物敏感性。通过 RNA 干扰技术下调 HIF-1α表达后,分为对照组和干扰组,观察 GST-π的表达。结果设常氧组 GST-π mRNA 表达率为1,缺氧组为12.2。常氧组 GST-π蛋白阳性表达率为(35.78±1.25)%,缺氧组为(72.13±2.11)%。与常氧组比较缺氧组 HIF-1α表达明显增加。计算1%克隆存活的药物浓度,阿霉素处理细胞,常氧组浓度为(0.29±0.05)μg/ml;缺氧组浓度为(0.48±0.07)μg/ml;丝裂霉素处理细胞,常氧组浓度为(0.71±0.10)μg/ml;缺氧组浓度为(0.79±0.12)μg/ml。干扰 HIF-1α后,HIF-1α mRNA 与对照组比较下降了70%,而 GST-π mRNA稍有下降。GST-π蛋白表达常氧条件下对照组为(32.14±1.23)%,干扰组为(30.88±1.65)%;缺氧条件下对照组为(64.78±2.45)%,干扰组为(67.42±2.21)%。结论长期缺氧可诱导 SPCA1细胞HIF-1α和 GST-π表达增加,对阿霉素耐药性增加,对丝裂霉素没有影响,HIF-1α和 GST-π并没有直接的相关性。

^18F-氟赤式硝基咪唑肿瘤乏氧显像实验研究

目的探讨^18F-氟赤式硝基咪唑（FETNIM）在肿瘤乏氧诊断中的应用价值。方法30只SPCA-1人肺腺癌荷瘤BM-B／c裸鼠采用随机数字表法分为A和B2组（鼠数分别为16和14只）。尾静脉注射37MBq^18F-FETNIM后A组分别于注射后0．5，1，2，3h处死裸鼠，取血液、肺、心、肝、脾、肾、肿瘤等组织测量质量，用1计数仪测定放射性计数，计算每克组织百分注射剂量率（％ID／g）；B组用PO2微电极测量肿瘤组织内乏氧情况。结果^18F-FETNIM在肾中代谢最高，在脂肪和骨骼中代谢较低，肿瘤／正常组织的放射性比值较高，且随时间而增加，2h达最高，肿瘤／血液放射性比值为1．69±0．37，肿瘤／肌肉放射性比值为1．57±0．47。HE染色显示瘤内有大量的乏氧坏死组织。组织内PO2微电极测量示肿瘤内均有乏氧，肿瘤内PO21．1～27．7mmHg（1mmHg=0．133kPa）。结论^18F-FETNIM在荷瘤裸鼠体内具有较低的外周代谢，脂溶性较低，能被肿瘤乏氧组织摄取，可用于肿瘤乏氧诊断。

RNA干扰HIF-1α增强人肺腺癌SPCA-1细胞放射敏感性的研究

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子1(HIF-1)增强人肺腺癌SPCA-1细胞的放射敏感性。方法构建干扰HIF-1α质粒pSUPER-HIF-1α,采用荧光定量RT-PCR、Western blot方法观察有氧与乏氧状态下RNA干扰HIF-1α的变化,用成克隆实验观察乏氧时RNA干扰HIF-1α对放射的增敏作用。结果在常氧和乏氧的状态下,RNA干扰HIF-1α引起mRNA的表达水平分别下降64%和76%;在乏氧的状态下,蛋白的表达下降。转染pSUPER-HIF-1α后的细胞存活曲线的D0值为2.5 Gy,转染空白质粒细胞和空白对照细胞的D0值分别为5.0 Gy和5.1 Gy,增敏比为2.1。结论RNA干扰HIF-1α可以增加SPCA-1细胞对放射的敏感性。

分子水平预测肿瘤放射敏感性研究进展

由于不同个体存在放射治疗敏感性差异,而传统放射治疗未能设计针对患者个体的治疗方式。随着人类基因组计划的完成和新技术的发展,设计针对个体更具合理的放疗方案,是医学发展的必然趋势。文章从DNA、RNA和蛋白三个水平预测肿瘤放射敏感性的进展作一综述。

RNA干扰下调拓扑异构酶Ⅰ在小细胞肺癌细胞株的表达及其与拓扑替康敏感性的关系

目的检测拓扑异构酶Ⅰ（TopⅠ）在小细胞肺癌（SCLC）细胞株中的表达，并探讨其表达水平对拓扑替康（TPT）敏感性的影响。方法采用Western blot检测TopⅠ在SCLC细胞株H446蛋自水平的表达；应用人工合成并荧光标记的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体瞬时转染H446细胞，流式细胞仪检测转染效率；应用定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot检测各干扰序列对TopⅠ在mRNA及蛋白水平的干扰效果，筛选最佳干扰序列；对转染后的细胞株进行药物敏感性实验，观察TopⅠ的表达对TPT敏感性的影响。结果TopⅠ基因在H446中有较高表达；siRNA干扰效果满意，转染效率可达86．7％左右；siRNA oligo TopⅠ-892、siRNA oligo TopⅠ-1152、siRNA oligo TopⅠ-2084和siRNA oligo TopⅠ-2397等4个于扰序列均抑制H446细胞TopⅠ mRNA的表达，抑制率分别为（95．7±1．6）％、（90．8±1．6）％、（96．1±2．7）％和（96．3±1．8）％。序列siRNA oligo TopⅠ-2084和siRNA oligo TopⅠ-2397干扰后，H446细胞TopⅠ蛋白表达明显降低。药物敏感性实验结果显示，相同浓度的TPT对实验组H446细胞的抑制率明显低于转染前及阴性对照的H446细胞（P〈0．01）。结论脂质体介导的人工合成siRNA瞬时转染可有效抑制H446细胞的TopⅠ表达，明显降低细胞对TPT的敏感性。

腹直肌肌蒂皮瓣一期乳房重建术的护理

手术为早、中期乳腺癌的首选治疗方案。乳腺癌行乳房切除后所致的胸壁畸形，给女性患者（尤其是年轻患者）造成极大的心理障碍，严重影响了康复后患者的家庭生活及社会活动。由于临床Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌行改良根治术后多不需进行全胸壁放射治疗，故乳房重建在选择性Ⅰ、Ⅱ期病...