哺乳动物细胞表面展示IgG抗体Fc组合突变库的构建及评估

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233~240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况。结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58%的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6%,3T3细胞的感染效率为47.4%;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92%的组合突变(9898/11520)。结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85%的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库。

肺腺癌放射敏感性受泛素结合酶2T抑制作用的研究

目的探讨泛素结合酶2T(UBE2T)对肺腺癌放射敏感性的影响及其可能的机制。方法收集2019年3月至2021年12月在遵义医科大学第二附属医院经病理证实, 且经单纯放射治疗的各期肺腺癌患者45例, 按实体肿瘤疗效评价(RECIST)1.1标准进行疗效评价, 分为放疗敏感组(25例)、放疗抵抗组(20例), 前者为完全缓解+部分缓解, 后者为疾病稳定+疾病进展。免疫组化(IHC)检测通过染色强度和阳性细胞数计分, 结合卡方检验分析患者石蜡标本UBE2T表达水平与放射敏感性间的相关性。利用人肺腺癌细胞, 构建慢病毒UBE2T干扰(UBE2Tsh)的A549细胞和UBE2T过表达的SPC-A-1细胞, 行放射及克隆形成实验检测细胞的存活分数, 多靶单击模型拟合生存曲线。免疫荧光技术检测DNA双链损伤(DSB)标记物γH2AX聚焦点水平(γH2AX聚焦点数/单个细胞)。蛋白质印迹法检测UBE2T、γH2AX、Rad51蛋白表达。流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。二分类变量资料统计采用Fisher’’s精确概率法, 计量资料采用t检验。结果 UBE2T高表达同肺腺癌患者放疗抵抗相关(P<0.05)。慢病毒UBE2T干扰提高A549细胞的放射敏感性, 放射增敏比(SER)为1.795, UBE2T过表达降低SPC-A-1细胞的放射敏感性, SER为0.293。UBE2Tsh A549细胞照射后细胞核内γH2AX聚焦点数显著增加(P<0.01), γH2AX蛋白表达量增加(P<0.01), Rad51蛋白表达量降低(P<0.001), UBE2T过表达SPC-A-1细胞γH2AX蛋白表达量降低(P<0.05), Rad51蛋白表达量增加(P<0.001)。UBE2Tsh A549细胞照射后G2期细胞占比减少(P<0.01), 细胞凋亡增加(P<0.001)。结论 UBE2T可能通过增强肺腺癌细胞放疗所致DNA双链损伤修复, 诱导细胞周期G2期阻滞, 减少细胞凋亡介导放疗抵抗。