猪细小病毒病研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种无囊膜DNA病毒,主要引起母猪繁殖障碍。该病毒在全世界广泛流行,我国猪场PPV感染率高达90%以上,给养猪业带来巨大经济损失。PPV经口、鼻传播,主要侵染猪的生殖器官,引起母猪的死胎、木乃伊胎和公猪的精液质量下降。临床采用接种疫苗的方式进行防控,起到了一定的效果。论文对病毒的基因组和蛋白特征、流行病学和疫苗研究进行综述,以期为PPV的基础研究和疫苗开发提供参考。

马立克病病毒单克隆抗体库构建及gB蛋白特异性单抗的筛选与鉴定

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病,制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PER TM细胞核和细胞质提取试剂,分别制备了vvMDV(MDV超强毒株)标准毒株Md5感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)核蛋白和浆蛋白,通过切向流超滤浓缩后制备免疫原,分别免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,常规细胞融合方法制备单克隆抗体杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)筛选,建立了一个容量为31株纯化的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,包括27株稳定分泌MDV-1特异性抗体和4株稳定分泌MDV-1、MDV-2和火鸡疱疹病毒(HVT)保守抗体的杂交瘤细胞株。经过293T细胞真核表达gB蛋白并结合IFA染色,其中1株单克隆抗体J-1F3-C6被鉴定为MDV糖蛋白gB的特异性单克隆抗体,其单抗腹水IFA效价为1∶25600,轻链型为Kappa,IgG亚型为IgG2a。进一步IFA染色表明,J-1F3-C6可特异性识别MDV-1、MDV-2和HVT毒株表达的gB蛋白,但在蛋白质免疫印迹(Western blot)分析中J-1F3-C6只与MDV-1和HVT发生特异性反应。综上,本研究建立了一个MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,并从中筛选鉴定了1株gB蛋白特异性的单克隆抗体,为后续研究奠定了重要基础。

盐酸克伦特罗单抗快速检测试剂盒的研制

以竞争性酶免疫分析原理为基础 ,应用特异性克伦特罗 (Clenbuterol,CL )单克隆抗体研制成功了β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗的快速检测 EL ISA试剂盒 (CL- Kit)。 CL- Kit线性检测范围为 0 .5～ 12 8μg/ L,各标准品的吸光值变异系数为 2 .3%～ 3.6 %。标准曲线呈典型的 S型 ,相关系数 R2 =0 .996 ,符合 4参数 L ogit曲线拟合。检测结果表明 :CL 单抗对 CL 的半数抑制量 IC50 为 7.94 μg/ L,对沙丁胺醇 (Sb)的 IC50 为 10 0 0 μg/ L,肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和来克多巴胺的 IC50 均≥ 6 4 0 0 μg/ L;CL- Kit与 Sb的交叉反应性为 0 .79% ,与异丙肾上腺素的交叉反应性为 0 .12 % ,与肾上腺素、去甲肾上腺素、来克多巴胺、各类抗生素及多种维生素均无交叉反应性。试剂盒测定回收率在 91%～ 10 5 % ,批内变异系数小于 2 0 % ,批间变异系数小于 10 %。

抗克伦特罗单克隆抗体杂交瘤的建立及其分泌单抗的免疫学特性鉴定

目的 :建立抗克伦特罗 (CL)单克隆抗体杂交瘤细胞系 ,制备CL单克隆抗体 ,并鉴定其免疫学特性。方法 :用重氮化法将半抗原CL偶联于载体蛋白BSA ,形成结合抗原BSA CL ;以BSA CL免疫BALB/C小鼠 ,应用杂交瘤技术建立分泌CL单克隆抗体细胞株 ;用体内诱生腹水法生产CL单抗 ,硫酸钠盐析法提纯。应用抗小鼠同种型抗体测定单抗的同种型 ,用竞争性ELISA和胶体金膜层析试验测定CL单抗的反应特异性和反应动力学。结果 :筛选出C 4G1、C 2H6、C 2D6和C 4C94株高敏感性和高特异性杂交瘤生产单抗 ,其单抗的间接ELISA效价分别为 5× 10 -5、3× 10 -4、6× 10 -4、2× 10 -5;同种型分别为IgG1/κ、IgG1/κ、IgG2a/κ、IgG2a/λ。C 4G1的亲和力常数K =1 6 8× 10 8L/mol,C 2H6的亲和力常数K =1 3× 10 8L/mol。经WestGold蛋白质印迹鉴定单抗与CL特异性结合。C 4G1单抗对CL的半数抑制浓度 (IC50 )为 7 94ng/ml,对沙丁胺醇 (Sb)的IC50 为 10 0 0ng/ml,对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和来克多巴胺的IC50 均≥ 6 4 0 0ng/ml;C 4G1单抗与Sb的交叉反应性为0 79% ,与异丙肾上腺素的交叉反应性为 0 12 % ,而与肾上腺素、去甲肾上腺素、来克多巴胺、各类抗生素及多种维生素均无交叉反应性。结论

氯霉素残留检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

在建立氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出CAP残留快速检测试剂盒(CAP-kit),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP-kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.9953,检测范围为1.0μg/L～128.0μg/L,灵敏度为0.85μg/L,半数抑制浓度(IC50)为7.54μg/L,检测限为1.0μg/L;牛奶样、猪肉样的平均添加回收率为88.3%、82.5%,平均批内和批间变异系数均<15%;CAP-kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。

西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清。通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定。结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功。动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清。

氯霉素单克隆抗体免疫金标快速检测试纸的研制及性能测定

以分泌抗氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析试验(GICA)成功研制出CAP残留快速检测试纸(CAP_Strip),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP_Strip的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,目测检测限为0.5μg/L;与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应为160%,与其他酰胺醇类和抗菌药物无交叉反应;其敏感性与竞争ELISA试剂盒相当,符合率为100%;10 min内显示结果,具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合CAP残留快速检测的推广应用。

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng.mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng.mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。

磺胺类药物在动物性食品中的残留与检测

磺胺类药物是一类广谱抗菌药,临床上主要用于预防和治疗细菌感染性疾病,还常作为饲料添加剂在动物生产中长期应用。然而,磺胺药会引起人过敏性反应,且可能有致癌性。因此,磺胺类药物的不合理使用,使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已倍受关注。因此,研究出一种操作简便、快速、灵敏的磺胺类药物残留检测方法,对于畜产品的安全具有实际意义。酶联免疫吸附法(ELISA)作为一种免疫学检测技术不仅具有上述优点,而且准确性好、特异性强、检测成本低,还可用于大批量样品的检测。而单抗在试剂的标准化及抗体的大量供应上明显优于多抗,所以单克隆抗体技术的应用在药残检测上是主要的发展方向。

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及免疫学鉴定

通过碳化二亚胺法(EDC法)制备免疫原OTA-BSA,并免疫小鼠,经杂交瘤技术建立产抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株。通过体内诱生腹水法制备腹水,纯化后对其亚型、效价、灵敏性、亲和性、特异性等免疫学特性进行鉴定;单抗亚类为IgG1型,间接ELISA效价1:6.4×105,IC50为112.8pg/mL,亲和常数为9.74×1011L/mol,与赭曲霉毒素B交叉反应率为5.6%,与其他常见真菌产物交叉小于0.003%;本实验制备的抗OTA单克隆抗体具有高效、敏感、特异等特点,适合OTA的免疫学快速检测。

猪乙脑病毒CSF.XZ-2D株的分离鉴定及其体外培养特性研究

为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征,本研究对临床流产胎儿脑脊液进行病毒盲传分离,经RT-PCR等分子生物学方法及乳鼠感染试验,分离鉴定了1株基因Ⅲ型JEV株,命名为CSF.XZ-2D。采用BHK-21细胞对该分离株的体外培养特性进行研究,结果表明,在25 cm2细胞瓶中,用1.25×106个细胞/瓶的初始量制备细胞单层,以较低剂量的病毒液吸附细胞并洗涤弃去游离病毒粒子,可在感染后60 h达到最大增殖量,病毒效价为105.0TCID50/0.1 mL以上。本研究为其他JEV分离株的体外培养提供了参考。

赭曲霉毒素A人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide NHS)法将赭曲霉毒素A(OTA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原OTA-BSA,采用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将赭曲霉毒素A(OTA)与卵清白蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果初步表明偶联成功。用OTA-BSA分10μg/只和50μg/只两个剂量分别免疫BALB/C小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗血清,效价可达1∶104,抑制效价达14.7ng,证明偶联成功,并显示低剂量免疫可以提高小鼠pAb的敏感性。本研究为OTA单抗的制备及其免疫学分析方法的建立奠定了基础。

河南商品蛋鸡群中鸡马立克氏病的流行病学研究

2011-2012年,河南省大面积暴发商品蛋鸡群肿瘤病,临床剖检疑似马立克氏病(Marek's disease,MD),为进一步确诊病因,根据马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)的meq、gB和pp38基因分别设计了3对特异性引物,利用PCR技术对送检的疑似病例鸡的肝脏和脾脏样品分别进行了检测和分析。结果显示,各地区随机抽取的5只病例鸡肝脏、脾脏样品中均扩增出3种不同大小的MDV特异性病毒基因PCR产物,这表明MDV在河南鸡群中广泛流行,并导致了商品蛋鸡群MD的暴发。研究结果填补了河南省MD流行病学空白,为今后MD的临床快速诊断及有效防控提供了重要参考依据。

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N,N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng.mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng.mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究

采用混合酸酐法将恩诺沙星（ENR）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原（ENR—BSA）和包被抗原（ENR—OVA）．将免疫原免疫家兔，制备多克隆抗体（ENRpAb），应用ENRpAb研制ENR残留阻断ELISA快速检测方法，并对其灵敏度、半数抑制浓度IC50、特异性、准确度进行测定．结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205ng／mL，灵敏度1ng／mL，半数抑制浓度（IC50）为11ng／mL，与其他化合物的交叉反应率（CR％）均〈0．1％，鸡肉样的平均添加回收率分别为87．35％，平均变异系数均〈10％．本检测方法具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合ENR残留快速检测的推广应用．

磺胺二甲基嘧啶人工抗原的合成及鉴定

用重氮化方法将SM2偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成了免疫抗原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2。紫外扫描及SDS-PAGE电泳结果表明,BSA-SM2,OVA-SM2的紫外吸收光谱与BSA,OVA,SM2相比均发生了改变;用BSA-SM2免疫BALB/C小鼠,获得了高效价和特异的多克隆抗体,表明半抗原SM2和载体蛋白偶联成功。

猪源乙型脑炎病毒河南分离株的全基因组测序及进化分析

为了解猪源乙型脑炎病毒(JEV)的全基因组结构及其分子进化规律,测定了3个JEV猪源分离株(BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3和CSF.XZ-2D)的全基因组序列,并对它们的氨基酸序列进行了分析。结果表明,CSF.XZ-2D全长为10 976 nt,而BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3全长均为10 977 nt,在后2个毒株基因组的10 701 nt位点处均有1个插入碱基"G"。BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3、CSF.XZ-2D与SA14株核苷酸和氨基酸同源性较高,核苷酸同源性都为99.4%,氨基酸同源性均为99.0%,与猪源分离株HW(HW1)、HWe(HW2)和SH0601的核苷酸与氨基酸同源性均为98.0%以上。用涵盖全部5个基因型的30个JEV毒株的全基因组序列构建系统进化树,发现这3个猪源分离株位于同一进化分支,均属于基因Ⅲ型。