无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存方法分析

为了制备无细胞百日咳效价测定用攻击菌并用液氮进行保存,对此方法进行评价。采用原代攻击菌复苏传代后测定细菌浓度,并用蛋白胨水稀释为27亿个菌/m l,分装冻存管中。放入液氮罐内,并对液氮保存的攻击菌进行相应的检测,用统计软件计算。结果显示,此方法制备的攻击菌与传统的攻击菌无显著性差异,冻后虽攻击菌的毒力有所下降,但都在100-1000/MLD的正常范围内,且冻后0、3、6、9、12月无显著性差异。同批支间差异小,CV<5%。通过此方法制备的攻击菌稳定性好,试验结果符合《中华人民共和国药典》要求,可用于无细胞百日咳的效价测定。

无细胞百日咳疫苗效价检定用攻击菌液氮保存的稳定性

为了考察无细胞百日咳疫苗效价检定用攻击菌在液氮中保存的稳定性,对液氮保存1~7年的4~9代百日咳攻击菌随机抽取7~11批次样品,采用LD50检测并经统计学处理,分析其样品的毒力变化。试验结果显示,4~9代的百日咳攻击菌液氮保存5年,毒力仍能达到《中华人民共和国药典》三部（2005版）的要求;保存6年和7年,4~7代的百日咳攻击菌毒力仍符合上述要求,8、9代的攻击菌毒力的合格率分别为84%和40%。试验证实,无细胞百日咳效价检定用攻击菌液氮保存5年具有良好的稳定性,可用于无细胞百日咳疫苗的效价检定。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)冻干保护剂的筛选

目的筛选适用于冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂。方法用同一批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液在同一冻干条件下,改变右旋糖酐40、海藻糖及人血白蛋白3种保护剂主要成分的含量,组合成6种保护剂配方,分别制备成半成品。冻干后检测成品外观、疫苗效力及热稳定性,确定最佳冻干保护剂配方。以最佳保护剂配方制备6批成品进行适用性验证,并选择3批成品进行长期稳定性验证。结果确定最佳冻干保护剂的配方为4%海藻糖、3%右旋糖酐40、1%蔗糖、0.5%甘露醇、2%人血白蛋白。以该配方制备的6批成品的各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)的要求,其中3批成品经2~8℃保存12个月后的效价较稳定。结论筛选获得了最佳冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂,且具有良好的稳定性。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在豚鼠体内主动过敏反应试验

目的观察冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在豚鼠体内主动过敏反应情况。方法将18只雌性豚鼠随机分为3组:阴性对照组(给予0.9%氯化钠注射液,致敏剂量为0.5 ml/只,激发剂量为1 ml/只)、阳性对照组[给予人血白蛋白,致敏剂量为20 mg/(0.5 ml·只),激发剂量为40 mg/(1 ml·只)]、供试品组[给予冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞),致敏剂量为1剂/(0.5 ml·只),激发剂量为2剂/(1 ml·只)],每组6只。致敏试验均经豚鼠后肢肌肉多点注射,隔日免疫1次,共免疫3次;末次致敏后14 d进行激发试验,均经豚鼠足部静脉注射给药,观察各组豚鼠的一般临床症状、体重及全身过敏反应症状。结果致敏期间,所有动物均未见异常表现。试验期间,各组豚鼠体重均呈增长趋势。静脉激发后,阴性对照组豚鼠未见过敏反应症状,过敏反应呈阴性;阳性对照组过敏反应呈阳性至极强阳性;供试品组动物过敏反应呈弱阳性至阳性。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)安全性良好,为其临床使用提供了实验依据。

Vero细胞对狂犬病病毒aGV株的易感性

目的探讨WHO引进的Vero细胞对狂犬病病毒（rabies virus,RV）aGV株的易感性。方法将RV aGV按MOI 0.01-0.1感染Vero细胞主代和工作代,显微镜下观察细胞形态;免疫荧光法观察感染24、48、72和96 h细胞内病毒的增殖情况;连续培养15 d,每天取上清液,采用免疫荧光法检测病毒滴度。结果 RV感染Vero细胞可致细胞圆缩病变,病毒感染第7天,病变率约为20%;RV感染Vero细胞主代和工作代24 h单个细胞内可见特异性荧光灶,48 h 20%-30%细胞内可见荧光灶,72 h 60%-80%细胞内可见荧光灶,96 h 90%-100%细胞内可见荧光灶;病毒感染后2-8 d,上清液中检测到的RV滴度均在103-108 FFU/ml之间波动,均为第8天达到高峰,达5.0×108FFU/ml以上。结论 WHO引进的Vero细胞对RV aGV株有较强的易感性,可应用于狂犬病疫苗的规模化生产。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)蛋白结构特性分析

目的分析冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)蛋白的结构特性。方法 SDS-PAGE电泳分离4批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液,电泳条带经nano LC-MS/MS进行蛋白鉴定,Native-PAGE分析病毒颗粒的完整性,并分析蛋白相对分子质量。同时进行N-末端氨基酸序列分析。结果 SDS-PAGE分析可见5个主条带,分别为狂犬病毒G、M、N、P蛋白及G蛋白二聚体(G-1),经nano LC-MS/MS鉴定,确定相对分子质量分别为74 000、21 885、57 287、40 934及141 067,各结构蛋白均包含在病毒颗粒中,M、N、P、G蛋白的N-末端起始氨基酸序列为分别为MNFLR、MDADR、MSKIF、MVPQA,与预期一致。结论 4批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液所含结构蛋白源于狂犬病病毒。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液批间一致性分析及组分鉴定

目的分析无人血白蛋白冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液的批间一致性,并对其组分进行鉴定。方法测定4批无人血白蛋白冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液的糖蛋白含量、总蛋白含量、残留DNA含量及内毒素含量;采用SEC-HPLC法检测原液的纯度。将峰2组分经还原烷基化酶解后,进行LTQ orbitrap velos质谱分析,并应用Proteo Wizard软件鉴定组分。结果4批疫苗原液的狂犬病病毒糖蛋白含量均值为31.78%,相对偏差为6.44%;总蛋白含量均值为167.04%,相对偏差为2.73%;残留DNA含量均<200 pg/剂,内毒素含量均<100 EU/mL;SEC-HPLC色谱图保留时间变化较小,峰1相对峰面积均值为93.1%,相对偏差为2.5%;峰2相对峰面积均值为6.9%,相对偏差为34.0%。峰2组分主要为狂犬病病毒颗粒裂解物、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Vero细胞来源泛素蛋白及痘病毒泛素蛋白。结论无人血白蛋白冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液批间一致性良好,成功鉴定了峰2的成分。

四书修身思想在语文教学中的实践与反思

'四书'修身思想是国学经典的重要组成部分,蕴含着中华民族优秀的传统文化精神,通过恰当、有效的途径在语文教学中弘扬'四书'修身思想有利于塑造学生的人格,有利于思想道德教育和行为养成教育,是传播民族文化的现实之需和理论之需。