基于RNA干扰抑制油菜种皮色素合成

甘蓝型油菜是我国最重要的食用植物油来源。在相同遗传背景下黄籽油菜的种子具有种皮薄、含油量高和蛋白质含量高、纤维素和多酚含量低、油质透明等优点。前人研究表明,油菜的模式植物拟南芥TT2基因与种皮颜色有关,而目前油菜TT2基因研究较少。为明确甘蓝型油菜TT2基因功能,利用RNA干扰技术沉默甘蓝型TT2基因。首先构建TT2基因RNA干扰载体,通过农杆菌介导法获得转基因材料。对花后15 d的幼种进行TT2基因定量表达分析。考察转基因材料农艺性状,收获种子进行冷冻切片观察种皮厚度变化,测定种皮中木质素、原花青素含量变化。结果显示种皮结实率降低,种皮颜色变浅。细胞冷冻切片结果显示,种皮变薄、栅栏组织稀疏。生理指标测定木质素、原花青素含量均下降。定量PCR显示,RNA干扰技术抑制油菜中TT2基因的表达。研究结果说明,甘蓝型油菜TT2基因特异性在种子内种皮表达,与预测一致。TT2基因缺失导致种皮色素积累减少,种皮颜色变浅,种皮厚度变薄,栅栏组织稀疏。木质素含量降低表明木质素代谢途径作为苯丙烷通路的分支受到TT2基因缺失影响。原花青素含量降低表明类黄酮代谢途径受TT2基因缺失影响。这与黄籽与黑籽油菜区别相一致。本研究为甘蓝型黄籽油菜种皮色泽的遗传性提供依据,推动甘蓝型黄籽油菜的育种进程。

发布企业科技实力榜:促进科技成果转化和增强企业科技实力的指挥棒

一、我国科技成果转化不畅、企业科技实力低下是一种顽症 当前我国科技领域存在一种讽刺现象，一方面大学和科研院所有大量的科研成果转化不畅．另一方面企业存在对科技成果的巨大渴求，但企业自身又普遍不重视科技研发。这种现象虽然早已受到关注．却始终没有明显改善．其核心原因是：

淹水对大麦与小麦若干生理生化特性影响的比较研究

涝害使大麦和小麦种子淀粉酶活性及幼苗干物重增长速度减慢,脱氢酶活性、叶绿素与蛋白质含量降低。根系可溶性糖低于对照,但茎叶可溶性糖及游离脯氨酸含量则高于对照。大麦对淹水的反应比小麦敏感,膜透性增高可能是其重要原因。大麦与小麦籽粒α-淀粉酶活性及植株蛋白质含量在涝害下迅速降低都是最为敏感的生化指标;而大麦本身最突出的变化还有茎叶可溶性糖及细胞电解质渗漏率的显著增加。适当喷施6-BA（10mg/L）可解缓植株的涝害症状,对大麦的抗涝性提高尤为有效,这可能与增强SOD酶活性,降低细胞膜透性有关。

不同烟区烤烟化学成分的主导气候影响因子分析

根据纬度差异和地理方位,将我国主产烟区的7省12县分为南北两大烟区,采用统一栽培模式,对两区烤烟(Nicotiana tabacum L.)主要化学成分和大田生长期不同时段的气候因素进行多元相关及逐步回归分析,初步获得了两烟区烤烟化学成分的主导气候影响因子。主要结果是:北方烟叶化学成分与气候因素的相关程度比较明显,南方烟区相对不显著,影响北方烟叶化学成分的气候因子多于南方烟叶。南北两烟区不同生育时段的气象因子与烤烟化学成分有不同的关联度,影响烟叶化学成分的主导气候因子明显不同,作用方向也各不相同。综合而言,北方烟区化学成分的主导气候影响因子是相对湿度、气温日较差和10 cm地温;南方烟区化学成分的主导气候影响因子是日照时数和降雨量。

芸薹属物种(B.napus,B.oleracea,B.rapa)MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。

农杆菌培养方式和预培养基激素配比对甘蓝型油菜下胚轴转化效应分析

利用根癌农杆菌共培养法转化甘蓝型油菜"华双4号"下胚轴,通过组织化学染色法检测报告基因gus的表达情况,研究了农杆菌培养方式和预培养基激素配比对转化效果的影响.结果表明,用LB培养基活化后的农杆菌再用添加AS的MS培养液继续培养6～30h对转化有明显的促进作用;不同的农杆菌培养方式对转化的影响有明显的差异,在试验的6种农杆菌培养方式中s2-5的转化效果最好,即收集活化后的农杆菌用MS+AS+抗生素重悬培养24h,再用MS+AS培养6h;2,4-D与6BA之间的相互作用对转化有重要影响,在试验的预培养基激素组合中,2,4-D2.00mg/L6BA0.25mg/L的组合转化效率最高;抗性愈伤率与转化效率之间不一定具有相关关系.

甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶17基因家族的克隆和比较分析

从甘蓝和白菜中分别克隆到2个PAP17,根据序列相似性,将PAP17分为类型I(BoPAP17-1和BrPAP17-1)和类型II(BoPAP17-2和BrPAP17-2)。Southern杂交表明,白菜和甘蓝中均只存在2个PAP17成员,与克隆结果吻合。系统发育和分子进化分析表明,PAP17基因家族受纯化选择,编码低分子量PAP蛋白。荧光定量PCR结果表明,PAP17在所检测的9个组织器官中均有表达,尤以花和蕾中的表达量特别高,种子中也有一定程度的表达,表明其与体内储备态磷的动用有关,尤其在花和蕾的发育阶段。磷饥饿诱导表达结果表明,除BrPAP17-2在幼苗叶片中表达受抑制外,BrPAP17和BoPAP17在幼苗根部和叶片中均受磷饥饿诱导,表达量先降后升,诱导4d或8d后达到峰值;恢复供磷4d后,表达量迅速降低至基础表达水平以下。与幼苗叶片相比,白菜和甘蓝幼苗根部的PAP17磷饥饿诱导表达似乎更为强烈。这些结果表明PAP17在白菜和甘蓝根部可能参与了根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组织器官的转运。

苯丙烷代谢途径中细胞色素P450的研究

苯丙烷次生代谢途径通过合成木质素、类黄酮等多种次生物质而影响植物的许多重要性状。细胞色素P450超家族参与苯丙烷途径的至少16种关键酶反应。从蛋白特征、功能、编码基因、表达调控等角度,综述了公共苯丙烷和主要分支途径中的细胞色素P450,如肉桂酸-4-羟化酶、类黄酮-3’-羟化酶、类黄酮-3’5’-羟化酶、阿魏酸5-羟化酶等。

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆及分析

以羽衣甘蓝为材料,克隆了全长2431bp的肉桂酸-4-羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子,mRNA为1715bp,编码一个481个氨基酸的推导蛋白,与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序,如血红素结合域、E-R-R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H/CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序(SRSs)和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C2242单碱基缺失和相应移码,导致其蛋白C-末端缺失/变异了36个残基,SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失,因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白,可能定位于内质网,其二级结构主要为α-螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。

植物肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因的研究进展

植物体内通过公共苯丙烷途径而进入木质素特异途径来合成木质素,这条代谢途径涉及到许多酶的参与,其中肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase,CCR)是木质素特异途径的第一个关键酶,可催化3种羟基肉桂酸的CoA酯的还原反应,生成相应的肉桂醛。因此人们认为此酶可能对木质素合成途径的碳流具有潜在的调控作用,对木质素单体的生物合成起着重要作用。本文主要综述了CCR在木质素生物合成途径中的地位、CCR的分布、酶的提取和基本特性、CCR基因的克隆进展、CCR基因的转录特点、CCR启动子研究情况、转基因植物中表达抑制CCR基因的生物学效应等,并展望了CCR基因研究对于植物木质素研究、植物抗病和抗逆性研究、作物品质改良以及植被保护研究的意义。

甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析

【目的】分析BnMAPK1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆BnMAPK1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BnMAPK1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜中克隆了MAPK1的启动子序列,发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。还发现植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和过氧化氢(H2O2),及损伤(wound)和核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)均能在转录水平上激活BnMAPK1。甘蓝型油菜在损伤和接种核菌盘后,JA信号途径标志基因PDF1.2的表达量被诱导上升,而SA信号途径标志基因PR-1被抑制,推测甘蓝型油菜可能是通过茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径响应损伤和病原菌入侵。【结论】甘蓝型油菜MAPK1受多种植物激素和胁迫的诱导,并且其启动子中含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件,可能MAPK1在植物体抵抗外界多种胁迫中起重要作用,并且甘蓝型油菜可能是通过JA信号途径对损伤和病原菌入侵做出响应。

抗黄萎病基因StVe转化番茄的研究

为了验证克隆自水茄(Solanum torvum Swartz)的StVe基因功能,将StVe连入中间载体p35S-2300::gus::noster的BamHⅠ和SacⅠ位点,取代gus基因构建植物双元表达载体p35S-2300::StVe::noster;用农杆菌介导法转化樱桃番茄22号,获得了72株卡那霉素抗性植株,PCR和Southern blot检测确认有5株为阳性植株;RT-PCR结果显示,StVe在转基因番茄植株间的转录水平表达存在差异;PDA平板抑菌试验显示,转StVe基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种1(Verticillium dahliae race1)生长的作用。

根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶GUS基因瞬间表达

为提高根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化甘蓝型油菜外源基因的瞬间表达率和优化遗传转化体系,利用根癌农杆菌共培养法转化甘蓝型油菜(Brassica napusL.)湘油15带柄子叶,通过组织化学染色法检测GUS基因瞬间表达情况,研究了预培养基、蔗糖浓度、无机盐浓度和乙酰丁香酮对GUS基因瞬间表达的影响。结果表明,预培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L、菌悬液为MS+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮100μmol/L或1/2MS+蔗糖60g/L+乙酰丁香酮100μmol/L时GUS基因瞬间表达率较高,达到约40%。

甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因BnECR的克隆及功能分析

反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥ECR基因设计引物,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR的全长cDNA序列和对应的基因组序列,命名为BnECR(GenBank登录号分别为FJ899705和FJ899706)。序列分析结果显示,BnECR的全长cDNA序列为1328bp,对应的基因组序列为2093bp,由4个外显子组成,在ORF的上、下游分别有一个163bp的5′UTR和一个232bp的3′UTR。根据编码区预测BnECR前体蛋白为一个310个氨基酸残基的多肽链,包含ECR蛋白的重要功能位点K144、R145及一个NAD(P)H结合基序G225SGGYQIPR/HG234。NCBIBlastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明,该基因与拟南芥AtECR基因的同源性最高,是对应拟南芥AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明,BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达,其中在茎中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子,表明BnECR可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。将BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中,分别转化野生型酵母By4743和突变体菌株YDL015c,添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明,BnECR在酿酒酵母中有效表达,转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%,比对照增加52%;对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。

葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究

葱兰和韭兰背景性状相似,但花色一白一红,是园林绿化常用的一对姊妹花,有必要对其花色成分类型和色差原因进行研究.该研究提取了葱兰和韭兰的花瓣色素,用特征颜色反应法、紫外-可见分光光度计法和薄层色谱法进行了鉴定.结果表明:葱兰花瓣色素主要为黄酮类的木犀草素,不含花青素;韭兰花瓣色素既含有黄酮类的木犀草素和另一种迁移率大的未知黄酮类成分,还含有花青素类的锦葵色素.韭兰花瓣中总类黄酮质量分数为9.505mg/g,其中花青素(苷)的质量分数为1.375mg/g,葱兰花瓣总类黄酮质量分数为5.21mg/g.韭兰的红色花色源于其比葱兰多出的锦葵色素或其糖苷.该结果将深入解析韭兰和葱兰花色物质的结构和生物合成途径、克隆其相关功能基因和开展花色分子育种.

甘蓝型油菜BnCHI-1基因的克隆和表达特征分析

为了解Bn CHI-1基因的表达与粒色差异之间的关系,采用RACE技术从甘蓝型油菜黑籽系5B中克隆了Bn CHI-1全长c DNA序列和基因组序列。Bn CHI-1的DNA序列为1 809bp。965bp的Bn CHI-1 mRNA含有一个756bp的ORF,编码包含251个氨基酸的多肽。预测发现Bn CHI-1蛋白存在查尔酮-黄烷酮异构酶结构域,底物2S-柚皮苷的结合位点以及氢键网络氨基酸残基活性位点。Southern杂交结果表明在甘蓝型油菜中有6个CHI基因成员。RT-PCR揭示,甘蓝型油菜5B的11个器官组织均有Bn CHI转录,其在茎、叶、蕾和花中的转录水平比较高,其次为种子和根,在子叶中最低。比较1对近等基因系(黑籽系L1和黄籽系L2)中Bn CHI转录水平,发现在花蕾、花、花后20d种子和花后30d种子中,二者的转录水平没有显著差异,但在开花后10d的种子中,L2中Bn CHI转录水平显著低于L1中Bn CHI转录水平。

激素对油菜子叶再生及转基因瞬间表达的影响

以甘蓝型油菜"湘油15"子叶为外植体,以MS为基本培养基,采用正交试验设计,研究了预培养基2,4-D和6-BA浓度、分化/共培养基NAA和6-BA浓度对子叶芽再生频率和转GUS基因瞬间表达率的影响.结果表明,激素对芽再生频率和转基因瞬间表达率都有重要影响,但激素对芽再生和转基因瞬间表达的影响效应具有不一致性.激素对芽分化的影响程度从大到小依次为再生培养基NAA、预培养基6-BA、预培养基2,4-D、再生培养基6-BA,推导的对于芽再生的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 1.0 mg/L和6-BA1.0 mg/L、再生分化培养基NAA0.2 mg/L和6-BA3.0 mg/L;激素对GUS基因瞬间表达的影响程度从大到小依次为共培养基NAA、共培养基6-BA、预培养基6-BA、预培养基2,4-D,推导的对于瞬间表达的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 0mg/L和6-BA0.2 mg/L,共培养基NAA0.05 mg/L和6-BA3.0 mg/L.推导的对于芽再生频率×GUS基因瞬间表达率的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 1.0 mg/L和6-BA1.0 mg/L,共/分化培养基NAA0.05 mg/L和6-BA3.0 mg/L.

甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立

利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR与Δ6-脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G。利用在Murashige和Skoog培养基（含有200μmolL–1乙酰丁香酮）培养5~7d的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69h（pCNR）,再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下,平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS分析和PCR分析结果表明,外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern杂交表明,这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸,γ-亚麻酸含量达8.2%。

福鼎大白茶愈伤组织的诱导条件优化

[目的]优化福鼎大白茶愈伤组织的诱导条件。[方法]以茶叶品种福鼎大白茶的幼嫩茎段为外植体,以MS为基本培养基,添加不同浓度的2,4-D、KT、NAA和蔗糖,研究不同激素组合、蔗糖浓度对其愈伤组织诱导的影响。在继代培养过程中,研究了不同抗褐变剂对愈伤组织生长情况的影响及抗褐变的效果。[结果]不同激素对福鼎大白茶愈伤组织的诱导影响依次为2,4-D>KT>NAA。适宜福鼎大白茶愈伤组织生长的培养基为MS+2,4-D1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L,pH值为5.8。在培养基中添加0.5%的活性炭和0.1%的聚乙烯吡咯烷酮可有效减轻愈伤组织的褐变。[结论]不同的激素组合、蔗糖浓度及抗褐变剂对福鼎大白茶愈伤组织的诱导均有较大影响。

用分子标记评价甘蓝型油菜骨干亲本的培育效果

从重庆市油菜工程技术研究中心的甘蓝型油菜骨干亲本中随机选取了32份材料用于研究,另外10份材料是来源于部分研究材料的同源株系或反交组合,用以辅助评价。分析了SSR多态性,65对引物共扩增出341条带,其中,具有多态性的带234条,占68.62%。以不同研究单位所选育的材料间平均遗传距离为相对标准(ck),32份材料间平均遗传距离为0.521,有22.92%超过ck。这些材料中,16份黑籽材料间的平均遗传距离为0.5389,有24.17%超过ck;16份黄籽材料间的平均遗传距离为0.4329,有9.56%超过ck;13份双低材料间的平均遗传距离0.5261,有19.23%超过ck。从所抽取的样本看,目前利用的骨干亲本尤其是黄籽亲本材料的遗传基础还不够丰富,今后要拓宽骨干亲本的质源范围,现有材料也需要进行筛选和优化。