肠外致病性大肠埃希菌毒力因子研究进展

近年来,在人类饲养的伴侣宠物、猪、牛、羊、家禽以及林麝等动物体内均已分离到一种能够引发肠外组织感染的大肠埃希菌--肠外致病性大肠埃希菌(extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。ExPEC所具有的毒力特征使其能够在消化道以外的组织脏器中定殖增殖,在临床上能引起人和动物的严重感染甚至导致死亡。由于ExPEC导致的疾病存在治疗困难且易复发的特点,给医疗事业和畜牧业造成了巨大的经济损失。ExPEC较强的致病性与其携带的众多毒力因子密不可分。论文就已发现的ExPEC主要毒力因子研究进展进行分类阐述,并介绍了不同毒力因子在ExPEC感染宿主过程中的致病机制。

绵羊肺源大肠杆菌cyaA基因缺失对细菌致病力及生物被膜形成影响的研究

为了研究cyaA基因缺失对XJ10的生化特性、生物被膜(BF)形成以及致病力的影响,试验将复苏后的XJ10和XJ10-ΔcyaA涂布于LB培养基,37℃培养过夜后观察菌落形态;通过生化鉴定仪对XJ10和XJ10-ΔcyaA的单菌落进行生化鉴定;采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10和XJ10-ΔcyaA,观察不同时间段BF形态;对昆明系小鼠进行腹腔注射,通过观察小鼠精神状态及死亡数来研究XJ10与XJ10-ΔcyaA的毒力。结果表明:与XJ10相比,XJ10-ΔcyaA的菌落形态未发生明显改变,但是生长缓慢,且直径明显小于XJ10的菌落;XJ10-ΔcyaA对蔗糖、侧金盏花醇、D-麦芽糖、β-半乳糖苷酶、D-甘露醇、D-海藻糖、D-山梨醇反应均为阴性,失去了对它们的利用能力;XJ10可以形成完整的BF,但XJ10-ΔcyaA未形成BF;小鼠毒力检测发现XJ10-ΔcyaA的致病性降低。说明cyaA基因可以影响XJ10对部分碳源的利用,缺失cyaA基因的XJ10的BF形成能力以及致病力都明显下降。

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。

绵羊大肠埃希菌生物被膜形成及相关基因的检测

检测绵羊大肠埃希菌中的XJ10生物被膜(biofilm,BF)形成情况并确定与BF形成相关基因的携带情况。采用96孔聚苯乙烯微孔板培养XJ10观察BF的形态和测定OD值分析XJ10BF在不同的时间段形成的情况,采用PCR方法检测BF 12种形成相关基因的分布情况。结果表明,在37℃,BF的OD值从2 h开始逐渐升高,24 h左右接近最高峰,维持至36 h后,OD值开始缓慢下降,直至72 h仍维持较高水平,在整个检测时间段内XJ10BF OD值显著高于对照组,且差异显著(P<0.05);6 h时BF形成初具形态,8 h^10 h呈现不完整的网格结构,12 h时BF形成较明显的网状结构,24 h^36 h形成有序的较为密集的网格结构,48 h后网状结构开始解离和脱落。同时在XJ10中检测到了其中8种与BF形成相关的基因,测序结果与GenBank公布的相应序列同源性为97.2%以上。试验表明XJ10具有形成BF的能力,但形成能力较弱,且携带8个与BF形成相关的基因。

羊源D型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为了确定石河子地区规模化羊场出现呼吸道症状死亡羊的细菌性病原,采用常规细菌分离鉴定方法、细菌16SrRNA序列分析以及多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt,从病变肺组织分离鉴定细菌,利用5个荚膜血清型特异性基因确定其血清型,扩增分离株的16个毒力相关基因,分析分离菌致病性和对常用抗菌药物的耐药性。结果表明,从病羊的病变肺组织中分离鉴定到一株血清D型多杀性巴氏杆菌,具有较强的致病性;携带8个毒力相关基因,其片段序列与NCBI上己公布的多杀性巴氏杆菌参考株同源性在99%以上;分离株对青霉素、林可霉素、庆大霉素、复方新诺明耐药,对其他23种药物敏感。

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

从石河子及附近地区规模化牛场死于肺炎的犊牛肺脏中共分离8株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),为了确定分离菌株的血清型和基因型,分别进行了多重荚膜特异基因PCR检测、脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)分型和多位点序列分型(MLST)鉴定和分析。结果显示8株分离菌中,7株为荚膜A型,1株为荚膜B型;LPS-m PCR结果显示其中7株菌为L2,1株为L3基因型;MLST技术将8株细菌中的7株分为ST1型,1株分为ST44型,且两者亲缘关系较近。结果表明8株Pm以荚膜血清A型为主,根据LPS基因特异性将其分为2个基因型,基于管家基因的MLST将8株Pm分为两种ST型。

绵羊肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究

为了查清新疆石河子部分规模场引起羔羊死亡的原因,本研究对采集的病羊肺脏组织进行细菌分离,同时对分离菌株进行小鼠致病性试验、特异性基因PCR检测、药物敏感性试验和耐药基因PCR检测.结果显示:从病变肺脏组织分离得到10株细菌,分离菌为大肠杆菌,致病性强;分离菌株呈现多重耐药现象,对诺氟沙星、复方新诺明、氟苯尼考等17种抗生素耐药;检测到iutA、fyuA、ireA、hlyD和afa 5种毒力因子,strA、strB、aadA1/aadA2、Bla(TEM1)、Bla(OXA1)、Tet A和Tet B 7种耐药基因.本研究为该地区规模场绵羊感染大肠杆菌的防控和临床用药提供依据.

长链非编码RNA Gm35082-202对布鲁氏菌引起的细胞焦亡的影响

【目的】研究长链非编码RNA(lncRNA)Gm35082-202对布鲁氏菌侵染引起的细胞焦亡的影响,旨在为研究lncRNA参与布鲁氏菌引起的先天性免疫反应提供参考。【方法】在Ensemble数据库中查找并分析Gm35082-202在染色体上的位置、外显子等信息;采用RNAfold在线软件预测Gm35082-202的二级结构;通过KEGG、GO富集分析预测Gm35082-202功能;用牛种布鲁氏菌(S2308)以感染复数(MOI)为0.01侵染小鼠巨噬细胞(RAW264.7),在侵染不同时间点(0、4、8、12、24、36、48 h)收集细胞,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量;利用LncLocator网站预测Gm35082-202亚细胞定位,用实时荧光定量PCR检测Gm35082-202在细胞质、细胞核的表达;将3条Gm35082-202 siRNAs (siRNA1、siRNA2和siRNA3)、siRNA NC转染RAW264.7细胞,实时荧光定量PCR检测Gm35082-202的表达量,筛选干扰效率最高的siRNA进行后续试验。Gm35082-202-siRNA、Gm35082-202-siRNA-NC转染RAW264.7细胞24 h后,再用布鲁氏菌侵染,以PBS为空白对照组(PBS),只用布鲁氏菌侵染的细胞为侵染对照组(Bru)。侵染24 h后收集PBS组、Bru组、Gm35082-202-siRNA组(Bru-siRNA)、Gm35082-202-siRNA-NC组(Bru-NC)细胞,用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测各组细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-11、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18的相对表达量,用ELISA法检测各组上清液中细胞因子IL-1β、IL-18分泌水平;通过菌落计数,比较各组布鲁氏菌的胞内生存能力。【结果】基因结构分析表明,Gm35082-202是大小为525 nt的lncRNA(Trianscript ID:ENSMUST00000208164.2),含有2个外显子,位于小鼠7号染色体(Chr7:100 324 295~100 326 967),其二级结构含有多个茎环及多分枝内部环结构;KEGG信号通路富集分析表明,Gm35082-202主要参与NOD样受体、钙调节以及细胞因子信号通路的调控;GO功能分析结果显示,Gm35082-202功能主要涉及DNA转录、线粒体组分以及金属离子结合。布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞后,与0 h组相比,侵染4和8 h时Gm35082-202表达量显著增加(P<0.05),侵染12、24、36和48 h时表达量极显著增加(P<0.01);亚细胞定位预测结果表明,Gm35082-202主要分布于细胞核(58.3%),其次是细胞质(35.1%),布鲁氏菌侵染RAW264.7细胞0 h时,Gm35082-202在细胞核中分布比例为63.4%,在侵染4、24和36 h Gm35082-202在细胞核中的分布减少,分别为24.5%、29.6%和30.4%。Gm35082-202-siRNA1、Gm35082-202-siRNA3均极显著降低Gm35082-202的表达量(P<0.01),Gm35082-202-siRNA1干扰效率最高。与Bru组相比,Bru-siRNA组中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1β和IL-18基因的表达量均极显著降低(P<0.01),NLRP3和Caspase-11蛋白的表达量显著降低(P<0.05),Caspase-1蛋白的表达量极显著降低(P<0.01);细胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平均极显著下降(P<0.01);Bru-siRNA组胞内布鲁氏菌数显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌通过上调Gm35082-202表达促进巨噬细胞焦亡,该结果可为进一步探究布鲁氏菌侵染时Gm35082-202参与调控宿主细胞焦亡的分子机制提供参考。

绵羊肺源性致病性大肠杆菌的分离与鉴定

【目的】近年来,羊呼吸系统疾病日益频发,由肠外致病性大肠杆菌感染引起的呼吸道疾病也日渐增多,给养羊业带来了一定经济损失。本文旨在确定新疆石河子地区某羊场表现为呼吸道感染症状的病死羔羊的细菌性病原及其特性。【方法】采用细菌常规分离鉴定结合16S rRNA基因序列分析的方法从发病羔羊的肺脏中分离鉴定细菌,并对分离株进行药敏试验、特异基因PCR检测、小鼠致病性试验及肺脏组织的病理学观察。【结果】从病死羔羊肺脏组织分离得到一株致病性大肠杆菌,该分离株呈多重耐药现象,检测到iutA、fyuA和ireA三种毒力基因;病变肺脏肺泡壁毛细血管充血,界限不清,支气管管腔充血,周围淋巴细胞浸润、增生。【结论】从病死羔羊肺中分离的细菌性病原是肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)。