苯丙氨酸合成的关键酶基因aroG与pheA串联表达

ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ 是与苯丙氨酸合成有关的两个重要基因。在大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） 中，ａｒｏＧ 基因编码脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶（ＤＳ） ，该酶催化由糖代谢中心途径分流出来的磷酸烯醇丙酮酸（ＰＥＰ） 和赤鲜糖４磷酸（Ｅ４Ｐ） 缩合形成脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸（ＤＡＨＰ） 的反应；ｐｈｅＡ 基因编码一个双功能酶蛋白，它同时催化两步关键反应，即具有分枝酸变位酶（ＣＭ） 和预苯酸脱水（ＰＤ） 的两种功能。采用ＰＣＲ 技术分别从两个不同品系的大肠杆菌染色体ＤＮＡ 中扩增到ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ。当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌Ｐ２３９２ 中进行表达时，它们编码的酶ＤＳ、ＣＭ 和ＰＤ 活性分别提高４－３ 、４－４ 和２－２ 倍；导入短杆菌（ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２７３１ 中表达时，相应的酶活性分别提高１２－３ 、２－３ 和５－６ 倍。两基因的串联表达能大幅度地提高工程菌株的苯丙氨酸发酵产量。

大肠杆菌ppsA,pckA基因的克隆与串联表达

磷酸烯醇丙酮酸合成酶 (PpsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸 (PEP)的 2个关键酶 ,在大肠杆菌中分别由 ppsA和 pckA基因编码 .首先用PCR方法从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增得到了 ppsA和 pckA基因 ,并将ppsA ,pckA以单独或串联的方式克隆到大肠杆菌表达质粒pλPR上 .构建成的质粒pλPR ppsA ,pλPR pckA和 pλPR ppsA pckA导入E .coliP2 392菌株中表达 .结果表明 ,ppsA ,pckA基因的单独表达使宿主细胞的PpsA和PckA酶活力分别提高到 5 .2和 2 .5倍 ;串联表达使宿主细胞PpsA和PckA酶活力分别提高到 3.1和 2 .3倍 ,还使得以PEP为底物合成的 3 脱氧 α 阿拉伯庚酮糖 7 磷酸(DAHP)产量提高到 2 .1倍 .