新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒，（CHLY）并以其感染的MA-104为试验材料，较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察，并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定，鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒，直径在60-70nm之间，病毒粒子由双层衣壳包裹，呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中，可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高，核苷酸同源性为98．9％，结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。

半巢式RT-PCR快速检测犊牛轮状病毒方法的建立

目的根据牛轮状病毒的VP7基因设计了一对可以检测牛轮状病毒G6血清型的引物,成功地检测了牛轮状病毒G6血清型。使用该方法检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒,检测结果为阴性。敏感性试验表明本实验方法可以检测10-4稀释的样品。通过对23份临床样本的检测证实,PCR方法比聚丙烯酰胺凝胶电泳和病毒的分离试验灵敏度高,可以快速诊断轮状病毒病,并且能够同时鉴定轮状病毒主要血清型。

直接从粪便中检测致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的双重PCR方法的建立与应用

目的产肠毒素大肠杆菌(Enterototxigenic,Escherichia Coli,ETEC)是造成人和动物腹泻的主要病原之一,也是造成新生乳用犊牛腹泻的主要原因,一株ETEC可能产生一种或者多种肠毒素。根据产肠毒素大肠杆菌产生的两种主要毒素的基因序列,设计了两对引物,建立多重PCR方法。该方法仅用4.5小时即可检测出导致犊牛腹泻的产肠毒素大肠杆菌菌株,具有敏感度高、特异性强和检测速度快等特点。本试验的目的是用所建立的多重PCR方法来确定ETEC在导致犊牛腹泻中的作用。采用该方法对乳用犊牛的203个腹泻样品进行了检测,结果,用传统的分离培养方法得到的203株典型大肠杆菌中有135株为ETEC;其中LT阳性为105株,ST阳性为126株,LT+ST阳性的为96株,阳性率为66.5%。而采用直接从粪样中提取PCR模板的方法进行PCR,检测到146个犊牛粪样为ETEC阳性,其中LT阳性为112株,ST阳性为137株,LT+ST阳性为103株,阳性率为71.9%,明显高于传统的检测方法;并且所检测到的146个ETEC阳性的犊牛粪样完全包含用传统的分离培养方法得到的135个阳性粪样,且基因分型结果相同。

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物,在其上游引物内侧又设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体病典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示,该反应阳性率为58.3%,低于临床解剖和镜检结果。对该基因的序列测定结果进行分析,表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80%以上。从该基因来看,附红细胞体与立克次氏体没有同源性,而与肺炎支原体和穿透支原体亲缘关系较近。

来源于羊痘病毒的白介素-18结合蛋白基因的表达和活性研究

Some poxvirus genome of vaccinia subgenus encoded IL-18 binding prolein gene,which could block IL-18 activity but no sequence similarity to membrane IL-18 receptors.The sheep poxvirus genome subgenus also had this gene.A pair of primers spanning the ORF of goat IL-18 binding protein gene in sheep poxvirus genome were designed.This gene was cloned and expressed in E.coliwith pGEX-5X-3 plasmid.After being purified,the recombinant fusion protein could inhibit goat PBMC IFN- production induced by IL-18 in goat PBMC.

健康奶牛产道内正常菌群的研究

本试验从山东省不同奶牛场筛选出60头健康状况良好的奶牛，按试验要求分三组，第一组为20头8～15月龄的未配种的青年奶牛，第二组为20头处于干奶期（围产期）的奶牛，第三组为20头产后一个月的奶牛。采用常规细菌培养、分离、鉴定的方法从产道分离到细菌150株，其中乳酸杆菌46（30．70／4）株、表皮葡萄球菌39（26％）株、无乳链球菌21（14％）株、大肠杆菌23（15．3％）株、芽孢杆菌8（5．3％）株、棒状杆菌5（3．3％）株、念珠菌8（5．3％）株。比较结果显示，乳酸杆菌为正常奶牛产道内的主要寄生菌，其次是表皮葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌。但是未配青年奶牛的阴道内，乳酸杆菌的分离率并不高。试验发现，奶牛阴道内的寄生菌一般为2～3种。

产后健康奶牛子宫内细菌动态变化规律的研究

对4个不同奶牛场20头产后健康状况良好的奶牛每头奶牛采样器采集子宫样品,通过细菌培养、分离、鉴定等常规方法,对其子宫内细菌的动态变化规律进行了研究,以探讨产后健康奶牛子宫内细菌的动态变化规律及不同奶牛场之间的比较差异。结果表明,本试验还对产后不同阶段所分离到的细菌的种类和数量进行了详细的比较分析,在产后第2天,子宫内呈污染状态,细菌数量迅速增加,四组试验的计数结果分别达到了8.34×105、2.15×105、1.90×105、2.97×105,此后细菌数量呈缓慢增长趋势,在产后第8天时子宫内细菌计数达到最高,四组试验技术结果的平均数分别为:4.25×107、4.01×107、3.95×107、3.05×107。

通过16S rDNA全序列分析及鉴定牛沙门氏菌

通过16S rDNA全序列的DNA同源性分析以及PCR-RFLP分析，对从山东某奶牛场送检的腹泻死亡的犊牛内脏中分离到的一株沙门氏菌进行了血清型鉴定，得到其系统发育树状图。系统发育树分析表明，该沙门氏菌菌株与GENEBANK上发表的27株沙门氏菌的16S rDNA同源性较高，为97-99％，该沙门氏菌菌株与鼠伤寒沙门氏菌LT2（Salmonella typhimurium LT2）的同源性最高，达到了99．7％，表明该沙门氏菌菌株为鼠伤寒沙门氏菌。