EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用

建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7

肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157：H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157：H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L（g）。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157：H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7toxB基因的分片段克隆和表达

根据Gen Bank已有tox B基因全长序列,分别设计6对引物扩增tox B基因,克隆到质粒p GEX-4T-1,构建重组菌BL21(plys)(p GEX-4T-1-tox B),IPTG诱导表达重组蛋白质,用Western blot鉴定重组蛋白质免疫原性。tox B基因片段大小分别为1 531 bp、1 590 bp、1 609 bp、1 603 bp、1 525 bp和1 690 bp,重组蛋白质分子量分别为8.1×104、8.3×104、8.4×104、8.3×104、8.0×104和8.7×104。以兔源EHEC O157∶H7抗血清为一抗,Western blot分析结果显示6个重组蛋白质均具有良好的免疫原性。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 toxB基因缺失株的构建

为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白质对小鼠的免疫保护性

为了研究不同浓度的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Intimin和Tir-Tccp蛋白质对接受1010 CFUEHEC O157∶H7小鼠的免疫保护作用,将Intimin和Tir-Tccp蛋白质和佐剂充分乳化后,通过皮下多点注射免疫小鼠,对照组注射等量的磷酸盐缓冲液。共免疫2次,间隔14 d,末次免疫后14 d攻毒1只小鼠EHEC O157∶H7 1010CFU。每次免疫后的14 d通过断尾采血,用间接ELISA法检测血清抗体。攻毒后,观察小鼠精神状态,记录死亡数并检测排菌量。ELISA检测结果表明,Tir-Tccp蛋白质诱导小鼠产生IgG抗体水平明显升高,而Intimin诱导产生的IgG抗体升高不明显。攻毒后,各免疫组小鼠均死亡1只,存活14只,存活率为93.3%;对照组小鼠死亡4只,存活6只,存活率为60.0%。免疫组在攻毒后6 d,粪便中检测不到EHEC O157∶H7,对照组在攻毒后13 d仍有较高的排菌量。表明Intimin和Tir-Tccp蛋白质对小鼠起到了有效的免疫保护作用,能够减少EHEC O157∶H7在小鼠体内的定殖。

ARIMA乘积季节模型在西藏自治区包虫病月发病人数中的预测应用

目的基于西藏自治区2013年8月至2018年7月包虫病的发病人数,采用X-12自回归移动平均(X-12-ARIMA)乘积模型拟合时间序列模型,对发病人数进行预测,为包虫病的防治提供科学的依据。方法采用X-12-ARIMA乘积季节模型对西藏自治区包虫病月度发病人数进行趋势分解,并自动选择ARIMA季节调整乘积模型,以赤池信息准则(AIC)和贝叶斯信息准则(BIC)值最小为最优模型选择标准。结果X-12选择的最优乘积季节模型为ARIMA(1,1,0)×(1,1,0)_(12);预测方程为,拟合模型结果显示2013至2018年包虫病的月发病人数不仅呈现季节性波动,而且呈现波动性下降的趋势。结论ARIMA(1,1,0)×(1,1,0)_(12)能够应用于西藏自治区包虫病发病人数的预测,西藏自治区包虫病的发病人数具有明显的季节性波动,并且呈现波动性下降趋势。

挖掘突发事件幕后的精彩

采访突发事件是记者的必修课，更是新闻采访的重要基本功之一。然而，突发事件日日有，不可多得的好题材却隔月难逢。大多数的突发事件，都是类似普通车祸等的常规线索。所以，在线索平庸或隐含纠纷的情况下，如何改变战略，换一种采访角度，挖掘普通事件幕后不普通的故事，以独辟蹊径，创造新闻亮点，是摆在新闻记者面前的新课题，也是记者应炼就的真工夫。本文以记者本人的亲身采访经历为例，谈谈在此方面的粗浅体会。

人物群像采写的个性突破

新闻业内的同行都知道，新闻采写最忌没有个性化，没有个性化的新闻，既不能深刻揭示主题，又不能给读者留下深刻印象，但个性化的抓捕和突显，却是新闻采写的硬功夫，许多个性就淹没在共性之中，就像珍珠埋没在泥土中，需要发现，挖掘，擦拭，才能闪闪发光，沁人心脾。否则，珍珠只能睡在泥土中，变成了普通石块，实在是太可惜了，下面我就结合自己的一次亲身采访经历，谈谈群像采写中个性突破的粗浅体会。

牛源大肠杆菌O157:H7的分离及毒力基因鉴定

从2个牛场采集新鲜粪便,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,挑取可疑菌落用rfbE/fliC二重PCR和血清学方法鉴定。设计毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对O157:H7对分离株进行PCR鉴定。口服攻毒链霉素处理的BALB/c小鼠明确分离株致病性。结果显示,成功分离到7株出血性大肠杆菌O157:H7,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。毒力基因检测显示,其中6株毒力因子表型为stx1-stx2+eae+hlyA+tccp+,另有1株表现型为stx1+stx2+eae+hlyA+tccp+,各分离株tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。所采集样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检出率高达12%。1×1010 CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的5株O157:H7分离株全菌,小鼠存活率有差异分别为40%,50%,60%,20%,50%,各分离株在小鼠体内排菌时间也有差异分别为攻毒后7,9,13,13,15d。