三孢布拉霉crgA启动子的克隆和活性分析

【背景】CrgA是三孢布拉霉(Blakeslea trispora,Bt)中调控类胡萝卜素合成的关键负调控因子,其表达水平会影响类胡萝卜素的合成。【目的】克隆三孢布拉霉crgA启动子并分析其活性,为进一步解析CrgA表达调控机制奠定基础。【方法】通过综合微生物基因组(integrated microbial genomes,IMG)数据库提供的基因组序列,克隆crgA翻译起始位点上游2000 bp序列,分析其顺式调控元件和转录起始区域预测,通过RT-qPCR分析不同光照时间对三孢布拉霉crgA相对转录水平的影响;构建4个不同长度的crgA启动子截短序列驱动的GUS-mGFP5重组表达载体p1303-procrgAF、F1、F2和F3,利用农杆菌侵染整合到三孢布拉霉基因组中,在黑暗和光照条件下测定β-D-葡萄糖苷酸酶(β-D-glucuronidase,GUS)酶活性并观察荧光信号。【结果】crgA启动子不仅包含基础的TATA-box和CAAT-box元件,还包括多个与光响应相关的元件。观察荧光结果显示CaMV35S和构建的4个突变启动子均能在三孢布拉霉体内驱动下游基因表达,检测GUS酶活性发现procrgAF3活性最强,且截短的启动子活性均强于CaMV35S,btcrgA启动子序列在1499−989 bp范围内有激活下游基因表达的光响应元件。【结论】三孢布拉霉的crgA表达具有“光激活”和“光适应”现象,crgA启动子核心区位于procrgAF3序列,btcrgA启动子上具有响应光调控的顺式作用元件位于1499−989 bp。