亚洲玉米螟幼虫酚氧化酶原基因序列的生物信息学分析

酚氧化酶原PPO是昆虫免疫的关键酶,本文从生物信息学角度对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guen啨e幼虫PPO进行分析,为进一步研究其高级结构与功能的关系提供理论依据。利用我们已提交到GenBank的数据,采用在线分析及MEGA4和RasMol软件对亚洲玉米螟酚氧化酶原(Of-PPO)的核苷酸和氨基酸序列、系统发生关系和蛋白质三级结构进行分析。结果表明:Of-PPO全长cDNA序列有2686bp,包含一个2079bp的开放阅读框,其推导的693个氨基酸序列中包含6个组氨酸残基构成的2个铜离子结合位点,以及保守的硫羟酸酯区域。Of-PPO属于PPO2类群,其N端不含信号肽,无跨膜结构域区域,无糖基化位点,44个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中,有2段序列可能形成卷曲螺旋,有5个区域的氨基酸具较强疏水性,其二级结构中α-螺旋占22.54%,随机卷曲占56.79%。同源建模显示其三级结构为"α/β型"中的"滚筒结构",存在一个明显的空位,可能与该酶催化活性有关。本文可为Of-PPO的实验研究和应用开发提供有价值的信息。

亚洲玉米螟幼虫血淋巴中酚氧化酶原的多克隆抗体制备及免疫学特性分析

为探讨酚氧化酶原(PPO)的合成转运机制,采用硫酸铵沉淀、Blue Sepharose CL-6B亲和层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析等方法从亚洲玉米螟幼虫血淋巴中纯化得到PPO,纯化倍数为369.85,回收率为35.34%。采用免疫印迹和酶联免疫吸附进行纯化PPO的免疫原性及其多克隆抗体的效价测定,并以透射电镜检测PPO在亚洲玉米螟幼虫体壁和中肠中的分布。结果表明,纯化PPO蛋白全酶相对分子量约为158 kD;免疫2只鼠后所得pAb间接ELISA效价均高达10-5,其中第2号小鼠pAb效价最高为1∶4.08×104;PPO多克隆抗体具有相对较高的特异性;在亚洲玉米螟5龄幼虫中肠和体壁组织中金颗粒呈团状和点状分布。

亚洲玉米螟幼虫体内储存蛋白cDNA片段克隆与序列分析

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guen e)幼虫体内储存蛋白(SP)表达调控的分子机制,根据不同昆虫储存蛋白基因序列的保守区域,设计合成简并引物,采用RT-PCR技术从亚洲玉米螟5龄幼虫中扩增出一段cDNA片段,大小为892bp,编码297个氨基酸,预测分子量为35.7kD,理论等电点pI值为8.73。该基因序列中含有保守的幼虫储存蛋白(LSP)两个特征基序YFTEDIDLNTYYYYFHVDYP和TALRDPVFC。Blast P分析结果表明:该片段推导的氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura适量甲硫氨酸SP-1的一致性最高,为77%;与小菜蛾Plutella xylostella富含甲硫氨酸SP-1和SP-2、印度谷螟Plodia interpunctellaSP、美国白蛾Hyphantria cuneaSP-2和粉茎螟Sesamia nonagrioides适量甲硫氨酸SP氨基酸序列的一致性分别为74%、74%、72%、71%和65%。构建系统发育树分析了9种鳞翅目昆虫储存蛋白进化关系,结果显示:亚洲玉米螟cDNA片段氨基酸序列与小菜蛾富含甲硫氨酸SP-1的亲缘关系最近,与粉茎螟适量甲硫氨酸SP亲缘关系最远。

亚洲玉米螟幼虫体内抗菌肽的诱导

外源物侵染可引起亚洲玉米螟幼虫产生免疫应激反应,并诱导产生抗菌肽。为深入研究抗菌肽作用机制,作者给亚洲玉米螟5龄幼虫注射大肠杆菌,诱导其产生抗菌肽,并分析该抗菌肽的部分性质。结果表明:亚洲玉米螟幼虫注射3.0×106个/mL大肠杆菌后可诱导其体内产生一种相对分子量为12.1kD的抗菌肽,在12～36h内该抗菌肽的诱导表达量与时间成正比。此抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑制作用,100℃高温处理5min后具有明显的抑菌活性,pH为8.0时抑菌活性最强,抑菌圈直径达6.9±0.3mm,且具有一定的温度稳定性和酸碱稳定性。