基于生物信息学对肝细胞癌潜在枢纽基因的筛选及验证

目的:筛选网络数据库中肝细胞癌组织与非癌性肝组织中差异表达的基因,并探讨其中适合作为早期筛查肝癌及治疗晚期肝细胞癌(HCC)的分子标记.方法:从GEO数据库中下载3个数据集GSE121248、GSE101685和GSE14520,筛选差异表达显著的基因(DEGs),并对其进行基因功能富集和信号通路富集分析,利用STRING网站构建对应蛋白的相互作用网络,导入Cytoscape软件后用CytoHubb插件筛选处于关键位置前10位的枢纽基因.利用Kaplan-Meier生存分析比较枢纽基因表达差异对肝癌患者平均生存率的影响,并通过GEPIA验证枢纽基因在肝癌组织中的表达变化情况,进一步分析各枢纽基因所涉及的信号通路.结果:数据集GSE121248、GSE101685和GSE14520分别筛选出为187、536和253个DEGs(|log2FC|>2, adj.P<0.01).Venn图显示3个数据集中共同包含的DEGs有87个,其所涉及的细胞功能为类固醇代谢和氧化还原酶活性,所涉及的通路为视黄醇代谢及p53信号通路.87个DEGs对应的69个蛋白的相互作用网络中,筛选最大团中心性(maximal clique centrality, MCC)前10位的枢纽基因为CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2、ASPM和ESR1.Kaplan-Meier生存分析提示9个基因(CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM)高表达可能导致HCC患者的总生存期(OS)较差,而ESR1基因高表达时患者OS延长(P<0.05).GEPIA分析369例HCC组织和160例正常肝组织的结果显示,CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM表达升高,而ESR1表达下调(|log2FC|>1,P<0.05).这10个枢纽基因所涉及的信号通路主要为p53信号通路、细胞周期和孕酮介导的卵母细胞成熟.结论:9个枢纽基因CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM的高表达以及ESR1的低表达与肝癌患者的不良生存率密切相关,提示它们作为检测对象预测肝癌预后及作为干预靶点改善肝癌预后的可能.

在APAP、TAA诱导的肝细胞药物性损伤中C/EBPβ对FXR的调控机制

目的:通过生物信息学分析寻找对乙酰氨基酚(APAP)诱导药物性肝损伤(DILI)过程中的关键基因,并研究在APAP、硫代乙酰胺(TAA)介导的小鼠肝细胞药物性损伤中,CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)对法尼醇X受体(FXR)的调控机制。方法:采用生信分析筛选APAP诱导的DILI模型中的关键基因;通过RT-qPCR、Western blot法检测不同浓度的TAA(0、13、33 mmol/L)、APAP(0、2、5μmol/L)对小鼠肝细胞AML12中C/EBPβ及FXR的mRNA及蛋白水平表达的影响。针对C/EBPβ基因设计两条不同的shRNA,并分别克隆至pLKO载体,用于构建C/EBPβ稳定敲低的AML12细胞系;通过流式细胞术分析TAA、APAP对AML12细胞凋亡的影响。结果:(1)FXR是APAP所致DILI模型中的关键性基因;(2)TAA和APAP导致AML12小鼠肝细胞损伤中FXR的mRNA及蛋白表达水平均显著降低;(3)TAA和APAP导致AML12小鼠肝细胞损伤中C/EBPβ蛋白表达水平显著降低;(4)C/EBPβ稳定敲低的AML12细胞系中FXR的mRNA水平显著下调。(5)奥贝胆酸(OCA)可以抑制凋亡基因聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的表达。结论:在TAA及APAP诱导的肝细胞损伤中,C/EBPβ可能是调控FXR的关键基因。

LMO7通过靶向铁死亡促进肝细胞癌生长

目的 探讨LMO7在肝细胞癌(肝癌)中的表达及其调控肝癌增殖和生长的潜在作用机制。方法 基于Kaplan-Meier Plotter数据库进行生物信息学分析,验证LMO7与肝癌患者预后的关系。使用shRNA病毒感染后的肝癌细胞HepG2和PLC/PRF/5分成空白对照组(NC)、LMO7敲低组1(shLMO7#1)、LMO7敲低组2(shLMO7#2)3组。采用Western blot和qRT-PCR验证肝癌细胞中LMO7蛋白和mRNA相对表达量,细胞克隆形成实验检测LMO7表达对HepG2细胞增殖能力的影响。采用Western blot检测敲低LMO7后铁死亡相关蛋白ACSL4和P53的表达;流式细胞术检测敲低LMO7后的细胞周期和活性氧(ROS)表达量。两组LMO7表达比较采用t检验,3组比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 基于GEO数据库分析显示,肝癌组织LMO7表达明显低于癌旁组织(LSD-t=-3.038,P<0.05)。基于Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示,肝癌组织LMO7低表达与患者的不良预后相关(HR=0.50,P<0.05)。细胞克隆形成实验显示,shLMO7#1组和shLMO7#2组平均细胞克隆数分别为(64±10)、(95±26)个,明显多于NC组的(11±5)个(LSD-t=3.91,6.27;P<0.05)。Western blot检测显示,下调LMO7后肝癌细胞P53蛋白表达显著下调。流式细胞术检测显示,下调LMO7后HepG2细胞主要阻滞在G2/M期;shLMO7#1组和shLMO7#2组LMO7的ROS相对表达量分别为32.6±1.6、47.9±1.0,明显少于NC组的53.3±1.1(LSD-t=-20.12,-5.27;P<0.05)。结论 LMO7在肝癌患者中低表达,LMO7低表达与患者预后不良有关。低表达LMO7通过靶向抑制铁死亡相关基因P53的表达,进一步调控ROS和细胞周期,从而促进肝癌生长。