芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的：研究芹菜素（AP）对小鼠T细胞体外增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法：无菌分离小鼠淋巴结和胸腺细胞,MTT法检测不同浓度（25、50、100、150、200μmol/L）的AP对多克隆刺激剂刀豆蛋白A（ConA）诱导的T细胞增殖的影响,PI染色结合流式细胞术（FCM）分析细胞周期的分布,Annexin V-FITC/PI双染色结合FCM检测AP对T细胞凋亡的影响,以及AP与地塞米松（DEX）共同作用下T细胞凋亡的变化,并用MTT法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。结果：25-200μmol/LAP对T细胞无药物毒性作用,并明显抑制ConA诱导的T细胞增殖（P〈0·01）,使细胞周期停滞在G0/G1期,且呈剂量依赖关系;各浓度AP对T细胞凋亡均具有抑制作用,并明显抑制DEX诱导的T细胞凋亡（P〈0·01）,且呈剂量依赖关系。结论：在一定浓度范围内,AP明显抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外增殖,使细胞周期停滞G0/G1期,并明显抑制T细胞凋亡。

芹菜素对RAW264.7细胞增殖、分泌NO和吞噬功能的影响

为研究芹菜素（Apigenin，AP）对RAW264．7细胞增殖、分泌一氧化氮（nitrogen monoxidum，NO）和吞噬功能的影响，首先培养RAW264．7细胞至细胞对数生长期，然后MTT法检测不同浓度（25、50、100、150和200μmol／L）的AP对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW264．7细胞增殖的影响，再用Griess试剂盒检测上述浓度AP对LPS刺激的RAW264．7细胞分秘NO的影响，并用荧光微球检测其吞噬功能的变化．结果显示25～200μmol／LAP显著抑制LPS刺激的RAW264．7细胞的增殖，并明显抑制LPS刺激的RAW264．7细胞分泌NO，同时明显抑制LPS刺激的RAW264．7细胞的吞噬功能（P〈0．01），且呈剂量依赖关系．故在一定浓度范围内，AP显著抑制LPS刺激的RAW264．7细胞增殖、分泌NO和吞噬功能，故有望通过进一步研究将其开发成为免疫调节药物．

芹菜素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的抑制作用

研究芹菜素（apigenin,AP）对小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,探讨其作用机制,以及将其开发为免疫抑制药物的可能。无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L）的芹菜素预孵育4 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白A（concanavalin A,ConA）诱导T细胞活化和增殖,并用MTT法检测该药物浓度对T细胞的毒性作用。荧光标记抗体双染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞表达早期、中期和晚期活化抗原CD69、CD25和CD71的影响;以二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯（carboxyfluoresceindiacetate-succinim-idyl ester,CFDA-SE）染色结合流式细胞术,检测各浓度AP对ConA诱导的小鼠T细胞增殖的影响,并应用ModFit软件分析其增殖指数（proliferation index,PI）。结果显示,25-200μmol/L AP对ConA诱导的T细胞CD69、CD25的表达有显著抑制作用（P〈0.01）,且呈剂量依赖关系;25μmol/L和50μmol/L的AP抑制CD71的表达,但高浓度（大于100μmol/L）才有显著抑制作用（P〈0.01）。各浓度AP对ConA诱导的T细胞增殖均有显著抑制作用（P〈0.01）,且呈剂量依赖关系。表明在一定浓度范围内,AP可显著抑制ConA诱导的小鼠T细胞体外活化及增殖,有望通过进一步研究将其开发成免疫抑制药物。

米诺环素对小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖的影响

研究米诺环素(MNC)对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化和增殖的影响,并对其免疫调节作用进行初步探讨。以ConA刺激小鼠淋巴结来源的淋巴细胞,以不同终浓度的MNC与T细胞共培养,荧光抗体染色结合流式细胞术,检测T细胞早期活化抗原CD69的表达;用羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰(CFDA-SE)染色结合流式细胞术,并用ModFit软件分析T细胞增殖相关指数。结果:终浓度为10、25和50μmol/L的MNC显著抑制ConA诱导的T细胞CD69的表达,由ConA组的71.20%±1.08%,分别降低为64.43%±1.39%、53.34%±1.26%和33.65%±1.91%;CFDA-SE染色结果显示,培养48 h和72 h的ConA组T细胞的增殖指数(PI)分别为1.57±0.03和2.06±0.02,各浓度的MNC对ConA刺激的T细胞增殖具有明显的抑制作用,以50μmol/L的MNC抑制作用最明显,48 h和72 h的PI分别为1.01±0.02和1.03±0.01,与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。MNC能有效地抑制小鼠T细胞的体外活化和增殖。具有独立于其抗菌活性的抗炎作用。

胸腺细胞和细胞器水平的线粒体膜电势研究

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡；利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡；利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期；细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化：单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。

α-Galcer对小鼠NKT细胞超微结构的影响

本实验观察在α-半乳糖神经鞘胺醇（α-Galcer）诱导下，小鼠NKT细胞超微结构的改变．分离小鼠脾脏单个核细胞，MTT法观察细胞对α-Galcer的药物敏感性，流式细胞术分选活化和未活化的NKT细胞，并用透射电镜观察NKT细胞超微结构．研究发现在24h，50～100ng／mL的α-Galcer作用下，实验组NKT细胞的增殖活性显著高于对照组（P〈0．05）．流式细胞术结果显示实验组活化NKT细胞百分率明显高于对照组（P〈0．05）．电子显微镜观察显示，活化的NKT细胞呈典型细胞活化改变，凋亡的NKT细胞，核固缩，致密形成新月小体，核膜破裂，凋亡小体形成．说明α-Galeer可促使小鼠NKT细胞活化，且活化的NKT细胞产生大量分泌小泡．

α-半乳糖酰基鞘胺醇诱发小鼠流产机制初探

目的利用α-半乳糖酰基鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-Galcer)诱发性C57BL/6J小鼠流产模型,初步探讨NKT细胞活化与C57BL/6J小鼠流产的关系。方法孕7 d和孕10 d C57BL/6J小鼠,每组8只腹腔注射α-Galcer,72 h后处死鼠剖腹探察胚胎数量。于0,24 h取胎盘淋巴细胞,流式细胞术检测CD3+NK1.1+细胞百分率和CD69+/CD3+NK1.1+细胞百分率,ELISA方法检测α-Galcer处理不同时间血清孕酮(P)水平,并做子宫胎盘免疫组化切片观察。结果C57BL/6J小鼠可由α-Galcer引起流产。胎盘CD3+NK1.1+淋巴细胞在0,24 h分别为(2.96±0.22)%和(4.17±0.67)%,CD69+/CD3+NK1.1+细胞百分率分别为(6.54±1.13)%和(82.45±5.85)%。ELISA方法测得血清P浓度为(0.15±0.01)ng/ml与对照组(1.28±0.03)ng/ml相比差异有显著性。胎盘子宫免疫组化切片显示α-Galcer处理组孕激素受体(PR)表达明显强于对照组。结论α-Galcer可诱发C57BL/6J小鼠流产,NKT细胞的活化及其分泌的细胞因子可能是导致流产的主要原因。

小鼠NKT细胞体外扩增的初步研究

目的探索小鼠脾脏NKT细胞的分离、纯化及体外培养扩增的方法。方法分离小鼠脾细胞,制成单细胞悬液,α-半乳糖神经鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-Galcer)和rhIL-2作用下刺激其活化增殖,不同时间点取样,利用双色免疫荧光抗体标记技术和流式细胞术(FACS)检测NKT细胞纯度,并用MTT法检测其对靶细胞K562的杀伤活性。结果脾NKT细胞在第0、4、8、12天计数细胞总数为0.5×107、(1.3±0.1)×107、(1.9±0.2)×107和(2.2±0.2)×107,第0、4、8、12天纯度分别为(6.27±1.04)%、(8.54±1.58)%、(10.65±1.95)%和(21.36±4.34)%;α-Gal-cer和rhIL-2作用下,纯化的NKT细胞较脾新鲜分离的单个核细胞对靶细胞K562的杀伤作用强。在效靶比20∶1时,培养时间为4、8,12天的NKT细胞杀伤率分别为52.7%、71.2%和85.7%,明显高于脾MNC33.8%(P<0.05)。结论在α-Galcer和rhIL-2作用下,小鼠NKT细胞得到扩增,细胞纯度约为22%。在效靶比20∶1时,NKT细胞对K562细胞杀伤率约为86%。

基于体细胞突变数据库筛选免疫原性结直肠癌高频新抗原的方法

结直肠癌是世界高发和高致死率的恶性肿瘤。靶向新抗原的免疫治疗已被证实可以诱导癌症患者肿瘤持续消退,但这些特异性新抗原,仅适用于个体精准治疗。随着大量的高频肿瘤基因突变被发现,这些与突变相关的高频新抗原可覆盖更多人群,具有较强的临床意义。然而目前结直肠癌中是否也存在高频新抗原仍不清楚。本研究利用来源于321个结直肠癌患者的体细胞突变数据库,联合1种标准过滤和7种预测算法,筛选并获得了25个基于中国人高频分型HLA-A^*1101限制性的高频新抗原,它们均具有高亲和力(IC50<50 nmol/L)和高呈递分值(>0.90);其中,除了阳性对照多肽KRAS_G12V8-16外,11个高频新抗原能够在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)分泌γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ),证实具有免疫原性。选取免疫原性最强的新抗原C1orf170_S418G413-421及阳性对照多肽KRAS_G12V8-16体外刺激T细胞,利用流式细胞分选及单细胞转录组测序技术,获得其特异性CTL的免疫组库信息,所构建的TCR-T(T-cell receptor engineered T cell)能够识别新抗原并分泌细胞因子。以上结果表明,本研究开发了一种利用体细胞数据库预测并体外筛选验证具有免疫原性高频新抗原的方法,为结直肠癌及其他癌种的多肽、DC(dendritic cells)疫苗、TCR-like抗体、TCR-T等免疫治疗提供了重要的多肽靶点和TCR信息,具有实际的临床应用价值。

固有免疫调控蛋白PKR串联亲和纯化系统的建立及应用

目的构建固有免疫调控蛋白——双链RNA（dsRNA）调控的蛋白激酶（PKR）的串联亲和纯化系统（TAP），初步研究PKR蛋白功能，以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析。方法通过PCR扩增PKR目的基因，克隆至真核表达载体pcTAP—A中。将重组质粒pcTAP-PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默（PKRkd）的HeLa细胞，并检测PKR对固有免疫信号通路之一，即促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）激活的调控；最后利用串联亲和纯化试剂盒纯化分离与PKR相互作用的蛋白，验证PKR蛋白复合物的纯化情况。结果将重组质粒pcTAP-PKR转染PKRkd HeLa细胞后，24h后即可检测到PKR融合蛋白，相对分子质量约为75×10^3，其表达量随着转染时间的增加而减少；PKR的过表达可发生自我磷酸化，并引起了MAPK信号通路的激活；Westernblot结果显示，小规模TAP纯化试验成功分离纯化了PKR蛋白。结论成功建立了一个PKR表达和串联亲和纯化系统，并证明PKR具有调控MAPK信号通路活性，为今后鉴定与PKR相互作用的蛋白研究奠定了基础。