整合狂犬病病毒G蛋白的假病毒构建及应用

目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)G蛋白的假病毒,为RABV中和抗体检测及疫苗的研发提供有效实验工具。方法 通过无缝克隆技术构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G,通过抗体中和试验评估狂犬疫苗接种者体内的中和抗体水平。结果 成功在293T细胞内进行假病毒p-RABV-G的包装,p-RABV-G可以表达G蛋白,并能高效感染Huh7.5细胞。4位狂犬疫苗接种者21 d的血清对p-RABV-G的抑制效果处于最优水平,在1∶625倍数的稀释条件下对p-RABV-G的抑制率高达95.79%、98.26%、98.42%和98.88%。结论 成功构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G可用于狂犬疫苗的开发与中和抗体的筛选。在狂犬疫苗接种后的111 d,本文调查的4位接种者中的其中3位体内血清仍可对p-RABV-G产生抑制效果。

新型冠状病毒假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用

目的构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒,优化假病毒制备条件并应用于中和抗体活性检测。方法优化合成SARS-CoV-2刺突蛋白(S)基因,进行假病毒包装;通过Western blot检测S基因的表达;应用定量ELISA检测接种新冠灭活疫苗后血清中新型冠状病毒IgG抗体的滴度,同时应用假病毒中和实验对接种新冠疫苗后血清中和抗体活性进行评价。结果成功构建了整合SARS-CoV-2 S基因的表达载体pcDNA3.1-S,确定pNL4-3.Luc.R-E-∶pcDNA3.1-S最佳转染比例为2∶1,可成功包装出高滴度的假病毒粒子。Western blot结果表明S蛋白已成功地在假病毒中进行表达。SARS-CoV-2假病毒可感染Vero、Huh7.5、A549-hACE2和293T-hACE2等4种靶细胞,表明所构建的假病毒具有感染活力,且具有广泛的宿主范围,其中293T-hACE2细胞感染假病毒后相对其他细胞株可检测出更高的萤火虫荧光素酶活性。ELISA检测接种新冠疫苗后收集的血清,结果表明接种第二针灭活疫苗一周后可检测出较高血清IgG滴度(S/CO=10.27±3.33),半年后血清IgG滴度降低(S/CO=2.36±2.25);假病毒中和实验结果表明1例IgG阳性(S/CO=10.32)免疫后血清可有效抑制SARS-CoV-2假病毒的感染活力,中和效价达到1/1066。结论成功构建SARSCoV-2假病毒,该假病毒可用于后续有关SARS-CoV-2中和抗体活性检测和疫苗接种后体液免疫效果的评价研究。

巴瑞替尼在新型冠状病毒感染中对Ⅰ型干扰素信号通路的影响

目的 探讨巴瑞替尼在新型冠状病毒感染中的抗病毒作用及对细胞因子表达的影响。方法 首先使用SARS-CoV-2(MOI=0.1)感染Calu-3细胞系,通过RT-qPCR分析新冠病毒感染过程中炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β)、干扰素β(IFN-β)和干扰素刺激基因(IFIT2)mRNA表达水平。下一步用巴瑞替尼预处理Calu-3细胞2 h,之后感染SARS-CoV-2(MOI=0.1),分别在感染后0、24、36、48 h时间点收集细胞,比较药物处理组和未处理组中上述基因mRNA表达水平及对病毒复制的影响作用。结果 SARS-CoV-2感染Calu-3细胞后,可诱导促炎因子(IL-6、TNF-a、IL-1β)和干扰素及干扰素刺激因子(IFN-β和IFIT2)mRNA水平发生不同程度的显著上调,病毒感染组在感染48 h相对于未感染组上调了近100倍或以上(P<0.000 1),上述因子的mRNA表达水平随感染时间延长持续增加(P<0.001或P<0.000 1)。IL-8 mRNA水平上升幅度尽管无上述基因显著,但也呈现2~4倍的增加。巴瑞替尼预处理Calu-3细胞后,对胞内SARS-CoV-2的复制水平无显著抑制作用(P>0.05)。然而,该药物可显著抑制SARS-CoV-2感染诱导的IL-6和TNF-α水平的上调(分别下调5.25倍和3.90倍,P<0.01),对IL-8和IL-1β的水平影响不大。另外,该药物也可明显下调病毒感染对IFN-β和IFIT2水平的增加(分别下调10.51倍和90.78倍,P<0.000 1)。结论 巴瑞替尼药物尽管对新冠病毒在细胞内病毒载量水平无显著抑制效应,但可不同程度抑制新冠病毒感染诱导的炎症因子的大量释放,尤其对干扰素和干扰素刺激基因表达的抑制作用更加显著。考虑到IFN-Ⅰ反应在病毒感染过程中发挥重要作用,临床必须谨慎使用巴瑞替尼治疗COVID-19患者。

新冠病毒灭活疫苗接种者抗体动态演变规律分析

目的分析新冠病毒灭活疫苗接种者的抗体产生及其动态演变规律。方法在普通人群中采集新冠病毒灭活疫苗接种者静脉血422人份,采集时间分别为接种第一针后1周和1个月,第二针后1个月、3个月和6个月,第三针加强免疫后1~3月,采用酶联免疫吸附法检测新冠病毒IgM、IgG抗体及总抗体水平,分析接种后特异性抗体产生的动态演变规律。结果接种新冠病毒灭活疫苗第一针后1周和1个月的IgG阳性率分别为1.3%和22.4%,接种第二针后1个月、3个月、6个月的IgG阳性率依次为89.0%、63.2%和57.3%,第三针加强免疫后1~3月的IgG阳性率为97.7%,总抗体阳性率为100.0%。完成两针接种程序人群中,男性IgM阳性率27.8%(15/54)高于女性14.2%(19/134),差异有统计学意义(P<0.05),而男性与女性IgG阳性率、总抗体阳性率的差异无统计学意义(P>0.05);年龄组间,IgM阳性率在20~35岁组为10.2%(9/88),明显低于36~67岁组(25.0%,25/100),差异有统计学意义(P<0.05)。第三针加强免疫后Ig G、总抗体阳性率分别为97.7%和100.0%,高于接种两针的免疫人群(83.5%和83.5%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论接种新冠病毒灭活疫苗后,人体内新冠病毒抗体的产生与免疫学规律相符,在普通人群中第三针加强免疫后100.0%产生抗体。虽然IgM抗体水平在一定程度上受年龄、性别影响,在普通人群中应及时接种第三针加强免疫以减少感染新冠病毒的风险。