篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。

应用150 L篮式反应器培养Vero细胞制备脊髓灰质炎病毒的工艺

目的探索应用基于片状载体的150 L篮式反应器培养Vero细胞制备脊髓灰质炎(脊灰)病毒的工艺条件.方法按照不同的细胞接种密度,将146代Vero细胞消化传代并接种至150 L篮式反应器中,在相同条件下培养,分时间段取样后,通过检测葡萄糖含量间接监测细胞代谢情况,绘制细胞生长曲线,确定150 L篮式反应器最佳细胞接种密度及反应器最佳培养条件.在150 L篮式反应器内接种Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型Sabin株脊灰病毒培养,分别通过生化分析仪、微量细胞病变法、ELISA检测一定条件下病毒培养12~96 h的葡萄糖含量、病毒滴度、抗原含量等参数,确定病毒最佳收获时间.结果在基于片状载体的150 L篮式反应器细胞中培养Vero细胞的最佳细胞接种密度为1.5×10^(5)ml^(-1);Vero细胞葡萄糖代谢量在培养120~168 h达到峰值(≥225 g/24 h),细胞密度最高且生长状态稳定.脊灰病毒接种48 h后,随着Vero细胞病变程度的增加,葡萄糖代谢逐渐下降;各型脊灰病毒滴度和D抗原峰值均出现在72 h左右.结论确定了应用基于片状载体的150 L篮式反应器大规模制备脊灰病毒(Vero细胞)的工艺条件.

应用篮式生物反应器在BSL-3实验室进行病毒培养的评估

目的对篮式生物反应器在BSL-3实验室进行高致病性病毒培养的风险点加以评估,通过对病毒接种、培养、收获3个阶段环境中病毒浓度的监测判断其在BSL-3实验室病毒培养的安全性。方法用灭菌的拭子在病毒的接种、培养、收获3个阶段对篮式生物反应器的罐体及连接处进行涂抹采样,同时在安全柜中,用AirPort MD8空气采样器对病毒的接种和收获操作过成进行空气采样,并且对在3个阶段操作后,实验人员的个人防护装备进行涂抹采样,3种方式进行监测。结果在病毒接种、培养、收获3个阶段,篮式生物反应器的罐体及连接处采样病毒检测结果均为阴性,在病毒接种和收获操作过程中的空气采样病毒检测结果均为阴性,实验人员个人防护装备采样的病毒检测结果均为阴性。结论在BSL-3实验室采用篮式生物反应器进行病毒培养的方法是安全可靠的,通过检测结果显示其在整个操作过程中,未有病毒的泄露,进而确保了实验人员和实验室内环境的生物安全。

篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒工艺的建立

目的建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺。方法对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析并确定脊髓灰质炎病毒的最适培养工艺参数。结果载体装量400~600 g,细胞接种密度1×10^6个/mL时,葡萄糖消耗量最大,平台期持续2~3 d,此时细胞接种病毒最佳。以0. 01~0. 3 MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,采用199培养基于(33±0. 5)℃,pH 7. 4~7. 6条件下培养时,病毒滴度最高,HCP残留量较低,为最适培养工艺。结论初步建立了基于篮式生物反应器的脊髓灰质炎病毒高效制备工艺。

不同类型消化液消化Vero细胞的比较

目的 比较胰蛋白酶(胰酶)和TrypLE消化Vero细胞的效果,确定细胞工厂培养Vero细胞的最佳消化工艺。方法 10层细胞工厂中Vero细胞生长成致密单层后,分别用(37±1)℃预热的0. 25%胰酶和TrypLE及室温(18~26℃)的TrypLE进行消化,吸取消化后的细胞悬液进行细胞计数,并检测细胞活率。将消化后的细胞悬液接种至生物反应器中继续培养,检测葡萄糖代谢情况,并进行室温TrypLE消化细胞的重复性验证。结果 用(37±1)℃0. 25%胰酶、TrypLE和室温TrypLE消化细胞所获得的平均细胞密度分别为1. 70×10^6、1. 68×10^6、1. 65×10^6个/m L,细胞活率均在95%以上。与0. 25%胰酶相比,使用TrypLE消化的细胞再培养时葡萄糖消耗量较高。10层工厂细胞消化所获细胞数的变异系数(CV)为2. 47%,消化传代后Vero细胞培养阶段葡萄糖代谢量的CV均小于10%。结论TrypLE作用温和,消化时细胞损伤较小,重复性好,细胞工厂规模化培养Vero细胞过程中可利用TrypLE替代胰酶进行细胞传代。

CpG 7909/铝佐剂对新型冠状病毒灭活疫苗的免疫增强作用

目的:评价CpG 7909和铝佐剂联用对新型冠状病毒灭活疫苗免疫原性的影响。方法:制备含有CpG 7909和/或铝佐剂的新型冠状病毒灭活试验疫苗,于d 0和d 21采用肌内注射方式免疫小鼠,在初次免疫后14,28,35和42 d采血,通过体外中和实验评价CpG 7909联合铝佐剂对新型冠状病毒灭活疫苗的体液免疫应答增强效果;在初次免疫后d 42取脾脏,通过流式细胞技术和ELISPOT评价其对新型冠状病毒灭活疫苗的细胞免疫应答增强效果。结果:与单独使用铝佐剂或CpG佐剂的新型冠状病毒灭活试验疫苗相比,CpG 7909和铝佐剂的联合应用在体液免疫方面可以显著提高小鼠体内中和抗体水平,并对Delta株表现出强交叉中和活性;在细胞免疫方面,可以显著诱导特异性白介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)和生发中心B细胞(GCB)的活化。结论:CpG 7909联合铝佐剂能协同增强新型冠状病毒灭活疫苗诱导的体液和细胞免疫应答,并对Delta株具有良好的交叉中和活性。

Vero细胞传代过程中致瘤性的检测

目的为生物制品生产及研究用Vero细胞体系传代过程中的遗传安全性评价提供实验数据。方法对Vero细胞进行传代与冻存，并对不同代次Vero细胞进行体外与体内致瘤性检测，同时对不同代次Ver6细胞的蛋白质表达进行差异性分析。结果Vero细胞传代至270代并建立了14个细胞冻存库；不同代次Vero细胞体外与体内致瘤性检测结果均为阴性；200代以上的Vero细胞蛋白质表达水平有所变化。结论Vero细胞传代过程中虽然体外与体内致瘤性检测结果为阴性，但蛋白质组学分析有差异性蛋白表达，这为Vero细胞传代过程中的遗传安全性评价提供了实验参考。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗在动物体内的免疫原性及安全性评价

目的评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine derived from Sabin strain,s IPV）在动物体内的免疫原性和安全性。方法利用篮式生物反应器在Vero细胞上培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,收获病毒液,经超滤浓缩、柱层析纯化、病毒灭活后,制备三价s IPV,参考《中国药典》三部（2010版）相关附录方法检测宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）、宿主细胞DNA及牛血清白蛋白残留量,HPLC法检测纯度;采用SDS-PAGE、Western blot法及透射电子显微镜对病毒的特异性进行鉴定;将s IPV于第0和21天免疫Wister大鼠,微量中和法检测免疫后大鼠血清中和抗体水平,并与野毒株IPV（IPV derived from wild strain,w IPV）组进行比较;通过观察ICR小鼠单次肌肉和静脉注射给予s IPV后产生的毒性反应及豚鼠反复给予s IPV后出现的速发型全身过敏反应,评价疫苗的安全性。结果 s IPV残余牛血清白蛋白、宿主细胞DNA、HCP检测结果分别低于2.5 ng/ml、100 pg/ml和100 ng/ml,疫苗纯度达95%以上;病毒形态及直径大小与脊髓灰质炎病毒一致,兔抗脊髓灰质炎病毒多克隆抗体可与对应型别的脊灰病毒的VP1、VP2、VP3发生特异性抗原抗体结合反应,相对分子质量分别在31 000-38 000、27 000-32 000和26 000-28 000之间;二免后,s IPV大鼠血清中和抗体阳转率及GMT均高于w IPV组;小鼠的急性毒性和豚鼠全身主动过敏反应均为阴性。结论制备的s IPV具有良好的免疫原性和安全性。

WAVE生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的采用WAVE生物反应器培养Vero细胞制备乙型脑炎病毒灭活疫苗。方法利用2 L WAVE生物反应器和微载体经半连续方式培养Vero细胞,每24 h取样,观察细胞生长情况,实时监测葡萄糖浓度。待细胞长至单层时,以0.03～0.5 MOI接种乙型脑炎病毒。待细胞病变率达25%时,开始收获病毒液,病毒收获液经纯化后,制备乙型脑炎灭活疫苗,按《中国药典》三部(2010版)要求检测各项指标。结果 Vero细胞培养至6 d在微载体上长成致密单层,接种病毒后2 d,细胞病变率达25%,开始收获病毒液,收获量为1 L/d,可连续收获5～7 d,总计5～7 L病毒原液;病毒培养至第4天滴度达峰值,为8.54 LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论初步建立了WAVE生物反应器培养Vero细胞制备乙型脑炎灭活疫苗的方法。

乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）蛋白质分析

流行性乙型脑炎国际上统称为日本脑炎（Japanese encephalitis）,简称乙脑,是由黄病毒科虫媒病毒——乙脑病毒引起的一种侵害中枢神经系统的传染病.接种乙脑疫苗是预防流行性乙型脑炎的有效措施.目前国内使用的乙脑疫苗有减毒活疫苗和灭活疫苗[1].本文应用液相色谱-电喷雾质谱联用（LC/ ESI-MS）方法就本公司生产的乙型脑炎灭活疫苗（Vero 细胞）蛋白质成分进行了初步分析,以期对该类疫苗的研发及生产有所参考,同时希望能在疫苗类蛋白质成分分析及基因工程疫苗的构建方面提供方法学上的参考.

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液蛋白成分分析

目的对本公司研发的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液进行蛋白成分分析及鉴定。方法按照疫苗生产工艺,应用NBS篮式生物反应器生产单价脊髓灰质炎病毒原液,经超滤浓缩及分子筛和阴离子交换两步柱层析纯化方法,收集并灭活蛋白峰。透射电镜下观察病毒形态及大小;ELISA方法检测宿主细胞蛋白（host cell protein,HCP）及残留牛血清白蛋白含量;HPLC法分析单价灭活病毒纯化液纯度;液相色谱（liquid chromatography,LC）与电喷雾电离质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）相结合的技术鉴定样品中所含蛋白成分。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化液中可见球形病毒颗粒,直径25-30 nm;HCP、残余牛血清白蛋白含量分别低于50 ng/ml、2.5μg/ml;纯度大于95%;单价脊髓灰质炎病毒样品中含有相应血清型的脊髓灰质炎病毒基因组编码蛋白,且相应病毒蛋白成分数据库匹配相对分值在所含蛋白组分中均最高。结论Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒液经纯化后,有效去除了杂质蛋白保留了病毒蛋白组分,单价病毒纯化液病毒蛋白成分明确,纯度较高,为后续该疫苗的研发与生产提供了参考。

疫苗类生物制品清洁验证中总有机碳检测限度的评估方法及应用

目的阐明疫苗类生物制品清洁验证中总有机碳(total organic carbon,TOC)检测限度的评估方法。方法以脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)为例,检测各个工艺步骤中最难清洗物的TOC,每种检测3批,要求相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)≤10%。按照清洗方式将需清洗设备、容器具进行分类,根据公式计算各设备、容器具在最差条件下的TOC限度,选取最低值作为该种清洗方式的TOC检测限度。结果通过分类后各自计算,得到离线清洗(clean-out-of-place,COP)方法TOC限度标准为0.00209 mg/cm^(2),COP-手工清洗方法TOC限度标准为0.00202 mg/cm^(2),在线清洗(clean-in-place,CIP)方法TOC限度标准为0.00184 mg/cm^(2)。结论该TOC检测限度的评估方法可广泛应用于疫苗生产行业的清洁验证。

Capto Core 400和Sepharose 6FF在Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化工艺中的应用比较

目的:分别用新型复合型层析介质Capto Core 400和传统介质Sepharose 6FF纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒(Sabin strain poliovirus,sPV)去除宿主细胞蛋白(hostcell protein,HCP)和DNA,并且比较纯化结果及工艺参数。方法:用Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Vero细胞培养的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV浓缩液。分别检测纯化后sPV的D抗原含量、HCP残留量和DNA残留量,计算D抗原回收率、HCP和DNA去除率,并用t检验分析差异。结果:Capto Core 400与Sepharose 6FF纯化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sPV的D抗原回收率差异均无统计学意义(t值分别为1.09、1.08、1.02,P值均>0.05),但前者的Vero细胞HCP(t值分别为3.15、3.23、3.54)和DNA去除率均高于后者(t值分别为3.41、3.25、3.62),且差异有统计学意义(P值均<0.05)。Capto Core 400与Sepharose 6FF的介质使用体积比值为0.05,上样后纯化时间比值为0.04,工作缓冲液使用量比值为0.25,工艺线性流速比值为10,每升介质上样量比值为20,最大耐压力比值为2。结论:对比Sepharose 6FF,Capto Core 400可以更有效地去除Vero细胞HCP与DNA,各个工艺参数得到了优化,提高了sPV层析纯化的工作效率,并节约了时间和成本。

鸡胚细胞疫苗制品宿主细胞蛋白残留量检测方法的建立

目的建立鸡胚细胞疫苗制品中宿主细胞蛋白残留量的检测方法。方法制备鸡胚细胞蛋白和抗鸡胚细胞蛋白抗体，摸索ELISA双抗体夹心法的试验条件，建立酶联免疫检测方法，并进行各项指标的验证。结果纯化的鸡胚细胞蛋白抗体纯度达到90％以上，抗体效价可达1：128。蛋白质印迹法分析显示，纯化抗体与鸡胚细胞蛋白呈现特异性结合。该方法的线性范围为12．5—200．0ng／ml，相关系数≥0．9885；对已知浓度样品的回收率为92％～110％，变异系数为3．0％-9．2％。结论建立的ELISA双抗体夹心法对于检测鸡胚细胞疫苗制品中残留的蛋白含量具有良好的线性、专属性、精密性及准确性。

Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化的离子交换层析条件研究

目的研究Sabin株脊髓灰质炎病毒(Sabin strain polio virus,sPV)纯化的离子交换层析(ion exchange chromatography,IEC)条件。方法在不同层析条件下对sPV凝胶层析粗纯液进行IEC,设定的层析参数分别为介质Q Sepharose FF或Eshmuno Q、上样量30%或40%柱体积、流速(150±5)或(240±8)cm/h。分别检测各型sPV纯化液的D抗原含量、蛋白浓度、病毒滴度、宿主细胞蛋白残留量和Vero细胞DNA残留量,计算D抗原回收率和比活。结果Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原回收率均明显高于Q Sepharose FF IEC。在上样量40%柱体积、流速(150±5)cm/h条件下,Eshmuno Q IEC纯化的各型sPV纯化液的D抗原比活均高于Q Sepharose FF IEC,差异均有统计学意义(Ⅰ型:t=4.23,Ⅱ型:t=5.73,Ⅲ型:t=4.18,P值均<0.05),而且前者的宿主细胞蛋白残留量(Ⅰ型:t=8.29,Ⅱ型:t=7.89,Ⅲ型:t=8.18,P值均<0.05)和Vero细胞DNA残留量(Ⅰ型:t=4.23,Ⅱ型:t=4.56,Ⅲ型:t=4.78,P值均<0.05)均低于后者,差异均有统计学意义。结论用IEC纯化sPV时,以Eshmuno Q代替Q Sepharose FF可增加上样量和流速,从而缩短IEC时间,提高纯化效率。