卡格列净通过SIRT1-FOXO3α信号通路改善小鼠肾小球系膜细胞自噬功能

目的:探讨高糖条件下卡格列净对小鼠肾小球系膜细胞系SV40 Mes13自噬功能的影响及可能机制。方法:将SV40 Mes13细胞分别置于以下3组条件中:正常浓度葡萄糖(NG, 5.6 mmol/L)、高浓度葡萄糖(HG,30 mmol/L)和高浓度葡萄糖加卡格列净(100 nmol/L),干预时间为48 h。采用Western blot法检测观察沉默信息调节蛋白1(SIRT1)、叉头框蛋白O3α(FOXO3α)、p62、LC3B、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原α1(COL1A1)和Ⅲ型胶原α1(COL3A1)的表达水平,采用RT-qPCR检测FOXO3α和BNIP3及纤维化指标的表达水平。用携带SIRT1 shRNA的慢病毒转染细胞,构建SIRT1敲减的SV40 Mes13细胞株,置于上述3组条件下干预48 h,采用Western blot和RT-qPCR法再次检测上述指标的表达情况,并通过自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)标记观察细胞内自噬流的变化。结果:(1)Western blot结果显示,卡格列净可以改善SV40 Mes13细胞自噬功能,且该作用依赖于SIRT1:HG干预后,与NG组相比,SV40 Mes13细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ水平降低,而p62蛋白水平升高(P<0.05);与HG组相比,HG与卡格列净共干预后,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ水平上升,p62水平降低(P<0.05)。当SIRT1被敲减后,卡格列净对LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的上调作用和对p62蛋白水平的下调作用消失(P>0.05)。(2)卡格列净上调SIRT1-FOXO3α通路:空载病毒对照组中,与NG组相比,HG干预后,SV40 Mes13细胞SIRT1蛋白水平、FOXO3α蛋白水平及核转位和BNIP3 mRNA水平降低(P<0.05);HG与卡格列净共干预后,与HG组相比,SIRT1、核内FOXO3α和BNIP3水平上升(P<0.05)。当SIRT1被敲减后,卡格列净上述作用消失(P>0.05)。(3)卡格列净改善SV40 Mes13细胞纤维化:HG干预后,与NG组相比,SV40 Mes13细胞α-SMA、COL1A1和COL3A1水平上升(P<0.05);HG和卡格列净共干预后,与HG组相比,上述纤维化指标水平下降(P<0.05)。当SIRT1被敲减后,卡格列净上述作用消失(P>0.05)。结论:在小鼠肾小球系膜细胞SV40 Mes13中:(1)卡格列净通过上调SIRT1-FOXO3α信号通路,改善高糖环境下小鼠SV40Mes13细胞自噬功能;(2)上调SIRT1-FOXO3α信号通路从而改善自噬可能是卡格列净改善高糖状态下小鼠SV40Mes13细胞纤维化的机制之一。

恩格列净改善高糖诱导HK-2细胞凋亡的机制探讨

目的探讨恩格列净改善人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)凋亡的机制。方法将HK-2细胞置于正常葡萄糖、高葡萄糖、高葡萄糖+不同浓度的恩格列净共干预环境下培养48 h。采用蛋白免疫印迹法检测肾脏沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)、硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)以及裂解的半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)的表达水平。采用TUNEL染色评估HK-2细胞凋亡情况。结果蛋白免疫印迹结果显示,高葡萄糖培养48 h后HK-2细胞的TXNIP和cleaved Caspase-3表达水平均高于正常葡萄糖组,而SIRT1表达水平低于正常葡萄糖组(P均<0.05)。1000 nmol/L恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预48 h后,HK-2细胞的TXNIP和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平降低,SIRT1表达水平升高(P均<0.001)。TUNEL染色结果显示恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预组较30 mmol/L葡萄糖组TUNEL阳性细胞数少,且1000 nmol/L恩格列净和30 mmol/L葡萄糖共干预组凋亡改善更明显。结论恩格列净可能通过上调SIRT1的表达、抑制TXNIP表达,改善高糖诱导HK-2细胞凋亡。