核转录因子及其突变基因的克隆与GST融合蛋白的表达纯化及磷酸化活性的检测

目的:原核表达IκBα及IκBα(S32,36A)基因,纯化获得GST-IκBα及GST-IκBα(S32,36A)融合蛋白。方法:利用PCR扩增含有酶切位点EcoRⅠ及NotⅠ的IκBα基因,将其装入pGEX-5X-1原核表达载体中。通过点突变获得pGEX-5X-1-IκBα(S32,36A)质粒。将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白,再用Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定纯化后的融合蛋白。结果:成功构建了pGEX-5X-1-IκBα及pGEX-5X-1-IκBα(S32,36A)原核表达载体。在37℃条件下,0.1mmol/L的IPTG能够诱导表达大量可溶性GST-IκBα与GST-IκBα(S32,36A)蛋白;纯化的融合蛋白可被抗IκBα的单克隆抗体特异性识别。最后通过体外激酶试验验证了IκBα能被HeLa细胞中存在的上游激酶所磷酸化,而第32,36位丝氨酸突变后IκBα不具有磷酸化活性。结论:纯化的GST-IκBα/IκBα(S32,36A)蛋白具有生物学活性,可用于后续的生物学研究。