基于模块优化强化大肠杆菌合成乳糖-N-新四糖的研究

乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)作为人乳寡糖核心组分之一,在婴幼儿成长发育过程中发挥着重要作用。为寻找高效的LNnT生物合成方法,探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ为出发菌株,根据合成路径中的关键代谢物质将LNnT合成路径划分为:外源酶所在路径的模块A,UDP-半乳糖合成路径的模块B和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径的模块C。利用不同拷贝数质粒初步优化模块A、B和C的表达强度,当大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ共表达重组质粒pRSF-lgtA-A.act和pET-galE时,LNnT产量最高,达0.87 g/L。通过CRISPR/Cas9技术敲除setA和ugd强化模块A和模块B,获得的重组菌株E20合成LNnT产量达1.16 g/L。摇瓶发酵条件优化后,重组菌株E20合成LNnT产量达1.28 g/L。在5 L发酵罐中,LNnT分批补料发酵产量达15.53 g/L,发酵过程最高生产强度为0.43 g/(L·h)。模块优化强化大肠杆菌高效合成LNnT有望为人乳寡糖的高效生物合成提供理论基础,进而推进婴幼儿配方食品产业的革新。

工程大肠杆菌利用甘油和乳糖高效合成2’-岩藻糖基乳糖

本实验在大肠杆菌BL21star(DE3)中构建2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的从头合成途径,通过CRISPR/Cas9系统敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ,探究不同来源α-1,2-岩藻糖基转移酶对2’-FL合成的影响,调控合成途径基因的转录水平,并进行工程菌发酵条件优化。结果表明,初始工程菌摇瓶发酵72 h后2’-FL产量为0.34 g/L,敲除lacZ和wcaJ基因后发酵72 h合成的2’-FL质量浓度提高到2.12 g/L。脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)来源α-1,2-岩藻糖基转移酶WcfB产量提升效果最好,摇瓶发酵合成的2’-FL质量浓度达4.12 g/L。经发酵条件优化,工程菌BLW-2在28℃和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度0.2 mmol/L条件下,摇瓶发酵合成的2’-FL质量浓度提高至5.01 g/L,5 L发酵罐中分批补料发酵合成的2’-FL质量浓度达31.2 g/L。

不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中建立了2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的从头合成途径,通过CRISPR/Cas9系统敲除了β-半乳糖糖苷酶基因lacZM15序列和尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ,探究了操纵子、假操纵子和单顺反子3种不同通路配置对重组大肠杆菌合成2’-FL的影响。结果表明:从头合成途径的基因在大肠杆菌BL21 Star (DE3)过表达后摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度为0.34 g/L。敲除lacZ M15和wcaJ后,重组菌产生的2’-FL质量浓度增加到了1.26 g/L。在操纵子形式下,重组菌BS-7摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度最高,达1.92 g/L。BS-7在10 L发酵罐中分批补料发酵37 h后产生的2’-FL质量浓度达到14.04 g/L,2’-FL产率为0.59 g/(L·h),乳糖转化率为63%。因此,大肠杆菌合成2’-FL过程中,较低的基因表达强度更有助于提高其产量,同时可提高底物的转化效率。

超高压处理对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)肠道菌群的影响

为研究超高压(ultra-high pressure,UHP)处理对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)肠道菌群的影响,该研究通过16S rRNA测序的方法,分析100、200、400 MPa超高压处理5 min后牡蛎肠道菌群结构的变化。鲜活牡蛎肠道菌群主要以弧菌属(Vibrio)、支原体属(Mycoplasma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、Roseimarinus、丙酸菌属(Propionigenium)、Psychrilyobacter、气单胞菌属(Aeromonas)、油螺旋菌属(Oleispira)和黄单胞菌属(Xanthomonas)为主。超高压处理后,牡蛎肠道菌群的Chao1指数和ACE指数有所提高,而Shannon指数有所下降;葡萄球菌属、气单胞菌属、类香味菌属(Myroides)、肠球菌属(Enterococcus)和气球菌属(Aerococcus)的丰度显著降低;而黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和红杆菌科(Rhodobacteraceae)的海洋特色菌属的丰度显著增加,如400 MPa处理后,牡蛎肠道菌群主要由黄杆菌科组成,占比超过70%。此外,超高压处理能有效消除牡蛎肠道中常见腐败菌,如交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)和希瓦氏菌属(Shewanella)。这些结果表明,超高压处理可显著降低牡蛎肠道菌群的数量和多样性,并能有效减少牡蛎肠道中致病微生物菌属的丰度,使菌群结构的安全风险降低。

壳聚糖对牡蛎ACE抑制肽的脱腥工艺研究

运用单因素试验优化牡蛎肽的酶解制备工艺,添加0.6%中性蛋白酶在p H7.0、50℃条件下酶解3 h。应用1.0%壳聚糖溶液对优化后的牡蛎酶解液进行絮凝脱腥,4 800 r/min离心15 s即可达到显著的脱腥脱脂和杂质去除效果,固形物回收率80.5%,蛋白回收率79.5%,脂肪去除率达92.4%。得到透明无腥味的牡蛎多肽后,对多肽分子量进行分析,1 000 Da以下的占93.1%,500 Da以下的约占49.7%,对牡蛎多肽的血管紧张素转换酶(angiotensinconverting enzyme,ACE)抑制活性进行研究,IC_(50)为0.475 mg/mL,为开发制备低分子量、高ACE抑制活性的脱腥牡蛎肽提供理论支持。

魔芋葡甘聚糖对高尿酸血症大鼠的改善效应

目的探究魔芋葡甘聚糖对高尿酸血症大鼠的改善效应;方法用腺嘌呤与氧嗪酸钾联合饲喂酵母饲料的方法造成高尿酸血症的模型,56只雄性大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照1别嘌呤醇组、阳性对照2苯溴马隆组、高中低KGM组,喂养4w,每周测定一次指标,实验测定血清指标:尿酸(uric acid,UA)、肌酐(creatinine,SCR)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、过氧化氢酶(catalase,CAT)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总谷胱甘肽(total glutathion,T-GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)、脏器指数以及24h尿量和尿酸排泄量,并做了肾脏的病理学观察。结果别嘌呤醇、苯溴马隆与KGM分别不同程度地降低了高尿酸血症模型大鼠的血清尿酸、肌酐和尿素氮水平;与正常组相比,所有试验物均能减少高尿酸血症肾病大鼠的排尿量;KGM中剂量组的MDA含量最接近正常组;KGM中剂量组的血清SOD值显著(P<0.05=)低于模型组;各组大鼠的总谷胱甘肽含量无显著(P>0.05)变化;与正常组相比,模型组的GSH/GSSH比值显著(P<0.05=降低;各组大鼠肾脏体积明显大于正常大鼠肾脏;各组大鼠的脾体指数和肺体指数无显著(P>0.05)变化,但各组高尿酸血症大鼠的心体指数、肝体指数和肾体指数显著(P<0.05)上升;KGM高剂量组可有效清除大鼠肾脏中过量产生的尿酸盐结晶。结论本试验高尿酸血症大鼠造模成功,魔芋葡甘聚糖对高尿酸血症大鼠有改善效果。