显微成像分析技术在中性粒细胞运动及吞噬功能研究中的应用

目的:使用转盘式激光共聚焦显微镜及显微图像处理软件对中性粒细胞的运动及吞噬功能进行分析与评估。方法:使用Percoll分离液分离小鼠骨髓中性粒细胞,用PE荧光标记后与FITC标记的酵母聚糖颗粒(Zymosan)混匀,置于转盘式激光共聚焦显微镜下进行多通道时间序列成像。使用Volocity和Image J分析中性粒细胞的运动及吞噬相关参数,包括形态变化、运动轨迹、伪足振荡、结合吞噬指数,得出时间序列下各项参数的变化趋势。结果:中性粒细胞在受到Zymosan诱导后趋化作用明显,大部分细胞在短时间内发生极性化,在40分钟内能快速结合Zymosan,行使吞噬功能。结论:使用显微成像技术结合图像处理分析技术可准确、定量地分析中性粒细胞运动及吞噬功能,直观快速地对中性粒细胞的生理学状态进行初步评估。通过这项技术,得到正常生理状态下中性粒细胞对Zymosan的快速响应情况,为今后中性粒细胞相关功能学研究提供了参考依据。

BD Influx流式细胞分选仪参数调试和最佳条件的设定

目的:探索BD Influx流式细胞仪分选细胞亚群的调试参数和最佳设定条件。方法:使用两种质控试剂Rainbow Beads和Accudrop Beads作为实验材料,对BD Influx流式细胞仪的针孔、液流、荧光通道、前向角散射光信号、液滴频率、振幅和液滴延迟等参数进行优化。结果:使用型号为100μm的喷嘴,在液流聚焦清楚、液柱打入废液收集管的正中央、荧光光斑进入针孔中央且最亮、前向角散射(FSC)光光斑进入针孔中央且最亮、断点最高、液流分叉呈稳定的亮点、振幅为5.20±1.00以及液滴延迟为35.20±2.00等最佳设定条件下,其细胞样本分选纯度可达99%,工作效率可达95%。结论:流式细胞仪分选参数条件的设定,可为获得高纯度、高活性的细胞提供快速调试方法。

流式细胞术操作软件在小鼠造血干细胞检测中的应用比较

目的 :探讨流式细胞术中不同分析软件在小鼠造血干细胞分析中的特点和差异。方法 :使用小鼠骨髓细胞悬液作为实验材料,在BD Aria III和BD Influx流式细胞仪上检测小鼠造血干细胞,分别应用FACSDiva、FACSSortware软件对检测数据进行分析,并比较分析结果。结果:FACSDiva和FACSSortware软件在参数调节、补偿调节、圈门、数据保存和分选设置方面存在细微差异,均可以实现多色流式分析和高速流式分选。结论:FACSDiva和FACSSortware软件分析同一样本所得结果有较高的一致性,均是使用流式细胞仪不可或缺的工具。

BD FACSAriaIII流式细胞仪在血液学中的使用分析研究

目的:对BD FACSAriaIII流式细胞仪在应用中出现的故障原因进行分析、研究,为在科研工作中正确使用该仪器提供依据。方法:通过对2012-2013年实验血液学国家重点实验室技术平台BD FACSAriaIII流式细胞仪的使用情况进行统计,对使用过程中出现的常见故障和需要由厂商工程师现场解决的故障进行统计,总结出高发故障的原因及解决方法。结果:通过对BD FACSAriaIII流式细胞仪的故障进行分析,为高通量流式细胞分选仪的正确使用提供指导,提高仪器运行的稳定性。结论:正确的使用和良好的维护有助于保证BD FACSAriaIII流式细胞仪的正常运行,从而确保科研工作的顺利进行。

流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用

介绍了流式细胞仪的构造及其工作原理,阐述了流式细胞仪研究造血干细胞的原理,归纳了流式细胞仪和流式细胞术在造血干细胞造血功能的研究、靶基因对造血干细胞命运的研究、造血干细胞细胞周期的研究和药物等因素对造血干细胞分化功能的影响中的应用。比较了6种不同型号的流式细胞仪在造血干细胞分析和分选应用中的差异,分析了影响造血干细胞流式分析、分选的因素,以期为多激光多色流式分析和高速、高通量流式分选技术的研究提供思路。

两种急性髓系白血病细胞的超微结构和拉曼光谱特征研究

目的:研究急性早幼粒细胞白血病(M3)和急性单核细胞白血病(M5)细胞的拉曼光谱特征,建立使用拉曼光谱非标记鉴别两种急性髓系白血病的新方法,为临床实验研究提供基础。方法:分别收集4例M3和3例M5患者的白血病细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,从每例患者采集30至50个白血病细胞光谱。结合应用主成份分析法(principle component analysis,PCA)、判别函数分析(discriminant function analysis,DFA)和系统聚类分析对两类细胞的光谱进行分析和建立诊断模型,进而对M3和M5细胞的光谱进行鉴别,应用交互验证方法对诊断模型进行验证,同时结合透射电子显微镜下白血病细胞超微结构分析拉曼光谱的特征。结果:M_3和M_5细胞的拉曼光谱差别显著,M_3细胞在波数622、643、757、852、1 003、1 033、1 117、1 157、1 173、1 208、1 340、1 551、1 581 cm^(-1)等处的谱峰强度明显大于M_5细胞;鉴别诊断建模的总体分类准确率达100%(233/233),交互验证的分类准确率达97%(226/233)。结论:拉曼光谱分析结果显示,M_3细胞的生物大分子水平显著高于M_5;根据PCA-DFA及聚类分析建立的拉曼光谱诊断模型能够准确区分上述2种急性髓细胞白血病细胞,其结果与白血病细胞超微结构相符。

基于激光拉曼光谱技术鉴别四种急性白血病细胞系的方法研究

急性白血病的诊断基于一系列检测方法,细胞遗传学和荧光原位杂交方法旨在鉴定涉及白血病发生过程的特定基因和染色体改变,通过流式细胞术和分子生物学进行的免疫表型分析也是目前可用于明确诊断的检查手段。这些检查的侵入性和时效性方面的不足促使人们寻找以拉曼光谱技术为代表的新的方法和技术,以减少假设和诊断结论之间的时间间隔,有利于患者获得更好的预后。拉曼光谱技术可用来非标记识别血液中存在的血细胞和生化元素的光谱信息,例如氨基酸、蛋白质、脂质、核酸和类胡萝卜素,并且该技术在使用细胞系、血涂片和血清样本进行的不同类型血液学疾病的诊断中变得愈为重要,具有广阔的应用前景。实验研究了人急性T细胞白血病细胞系(Jurkat)、人急性骨髓性白血病细胞系(KG-1α)、人急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)的拉曼光谱特征,建立使用拉曼光谱非标记鉴别四种白血病细胞系的新方式,为临床实验研究提供科学基础。分别培养并收集四种急性白血病细胞系细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,每种细胞系捕获25~30个白血病细胞光谱。联合运用主成分分析法、偏最小二乘判别分析和聚类分析等光谱分析方法,对四种细胞系细胞的光谱展开深入分析和建立鉴别模型,联合两两组合分析,对细胞光谱进行甄别。四种细胞的拉曼光谱具有差异,主要通过769, 826, 844, 957, 1 048, 1 141, 1 255, 1 313, 1 415, 1 539和1 575 cm^(-1)等峰位进行区分,反映了jurkat细胞活跃的增殖代谢, KG-1α细胞活跃的与核酸相关的能量代谢以及NB4细胞较强的细胞呼吸等生物学信息。结果表明:依据PLS-DA建立的拉曼光谱辨别模型能准确甄别四种急性白血病细胞,模型具有良好的拟合稳定性、预判能力和应用前景。

人胚胎干细胞与急性早幼粒细胞白血病细胞的拉曼光谱特征研究

急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病(AML),是FAB分型中的M3亚型。部分APL患者形成早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因,即PML-RARα融合基因。在内外界多种因素的共同作用下,早幼粒细胞白血病发病。胚胎干细胞(ESCs)具有多向分化的能力,在一定诱导条件下, ESCs可以向造血系统分化。早幼粒细胞位于ESCs分化下游,为粒系分化阶段的一种细胞。探索一种非标记的技术方法鉴别不同分化阶段造血细胞具有重要的科研和实践意义。拉曼光谱技术可用于多种类型疾病的鉴别诊断研究,近年来应用前景愈加广阔。实验研究人胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和急性早幼粒细胞白血病患者(M3)白血病细胞的拉曼光谱特征,建立拉曼光谱非标记鉴别不同分化阶段白血病的方法,为临床实验研究提供基础。分别收集胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和4例M3患者白血病细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,每组或每例患者采集25~30个白血病细胞光谱。结合应用主成分分析法(PCA)、判别函数分析(DFA)、系统聚类分析和偏最小二乘判别分析(PLS-DA),对三类细胞的光谱进行分析并建立模型,进而对三类细胞进行鉴别,应用交互验证法对模型进行验证。同时结合细胞超微结构分析三种细胞的拉曼光谱特征。M3, NB4和ES细胞的拉曼光谱差别显著,主要表现为M3和NB4细胞光谱中对应核酸、蛋白质及脂类物质的谱峰明显高于ES细胞,其生物学机制包含了APL与PI3K/Akt/mTOR通路的密切关系。PI3K/Akt/mTOR通路在急性早幼粒细胞白血病细胞中存在异常激活,影响白血病细胞的生物大分子代谢;鉴别建模的总体分类准确率达100%(181/181),交互验证的分类准确率达98.9%(179/181),表明鉴别模型预测能力良好。拉曼光谱分析显示M3细胞和NB4细胞增殖代谢明显高于ES细胞,根据PCA-DFA、聚类分析及PLS-DA建立的拉曼光谱鉴别模型能够准确区分3种不同分化阶段白血病相关细胞,其结果与电镜结果相符。

基于FlowJo软件生物信息学降维方法的小鼠骨髓造血干祖细胞流式分析

目的:研究流式细胞术检测小鼠骨髓造血干祖细胞分析方法,探索建立使用流式细胞术结合生物信息学分析小鼠造血干祖细胞的新方法,为实验血液学研究提供基础。方法:使用流式细胞仪进行小鼠骨髓造血干祖细胞流式分析;使用FlowJo软件对造血干祖细胞结果应用t-分布邻域嵌入算法(t-distributed stochastic neighbor embedding,tSNE)、统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection,UMAP)和流式自组织特征映射(flow self-organizing feature map,FlowSOM)分析,并对分析结果进行比较,探索通过生物信息学降维方式分析小鼠造血干祖细胞流式结果的新方法。结果:tSNE、UMAP和FlowSOM分析可以通过降维直观地反映群体细胞的抗原表达水平,并对细胞进行分群和聚类。其分析结果与传统流式分析所得细胞群比例相符。结论:流式细胞术结合FlowJo软件建立的小鼠骨髓造血干祖细胞分析方法可以很好地评价造血干祖细胞各群分布和比例,具有较好的稳定性和评价能力。

两种流式细胞术分析软件用于检测小鼠骨髓造血干祖细胞的方法比较

目的:探讨流式细胞术中两种不同分析软件在小鼠造血干细胞(HSC)分析中的特点和差异。方法:使用小鼠骨髓细胞悬液作为实验材料,采用BD AriaⅢ流式细胞仪检测小鼠造血干祖细胞(HSPCs),分别应用BD FACSDiva Software v6.1.3和FlowJo 7.6.1软件对检测数据进行分析,并对比分析其数据结果。结果:FACSDiva与FlowJo软件在数据导入、数据显示、圈门、补偿调节、数据导出和特色分析等存在细微差异,各项检测指标均可实现多色流式细胞分析功能。结论:FACSDiva和FlowJo软件分析同一样本所得结果具有较高的一致性。

拉曼光谱技术与神经退行性疾病研究进展

随着社会老龄化加重,神经退行性疾病是导致老年人高致病率和残疾率的主要原因,造成重大社会经济负担,受到越来越多的关注。由于其起病隐匿,发展缓慢,病理生理变化复杂,目前尚无明确、特异、可靠的实验室方法对其进行早期诊断。拉曼光谱技术是一种通过光与物质的相互作用产生的非弹性散射光来进行检测的光学技术,它通过检测分子的散射光来提供细胞、组织或生物流体的化学指纹信息。越来越多的生物医学应用表明,拉曼光谱在检测新的生物标志物方面具有潜力,可以快速准确地筛查疾病的易感性和发病情况,在研究临床相关生物物种、疾病发病机制和诊断方面有广阔的应用前景。本文就拉曼光谱技术对神经退行性疾病的早期诊断方面前景进行概述。

仪器维护与技术培训一体化在流式细胞仪管理中的应用

以BD CantoⅡ流式细胞仪为例,介绍了检测正常人外周血na?觙ve细胞和静息态T细胞的标准方法,重点演示了仪器校准、电压调节、补偿调节等实验模板的建立流程;以BD Influx流式细胞仪为例,介绍了流式细胞仪的结构与功能特点以及平台多色流式细胞术技术培训中的相关内容;列举了BD Influx流式细胞仪的常见故障、引起故障的原因及排除方法,探讨了流式细胞仪日常维护和专项技术培训一体化管理模式,旨在为相关仪器管理者和使用者以及科研院所提升流式细胞仪管理和服务水平提供借鉴。

人骨髓CD106^+间充质干细胞亚群与CD106^-间充质干细胞亚群生物学功能的比较

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)中CD106+MSCs亚群与CD106-MSCs亚群生物学功能的差异。方法取人骨髓扩增MSCs,然后分选CD106+MSCs亚群与CD106-MSCs亚群,检测细胞增殖、黏附功能、趋化功能、向成脂成骨分化能力、衰老情况、衰老蛋白p21;检测细胞受到肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激时,胞内核因子-κB(NF-κB)转入细胞核内的能力等。结果 CD106+MSCs亚群比CD106-MSCs亚群增殖功能增强,CD106+MSCs亚群组光密度(OD)值明显高于CD106-MSCs亚群组OD值(48 h:1.004±0.028比0.659±0.023,t=3.946,P=0.0225;72 h:2.574±0.089比1.590±0.074,t=11.240,P=0.0000)。CD106+MSCs亚群组比CD106-MSCs亚群组黏附能力更强,两组OD值分别为0.648±0.018、0.418±0.0234,两组比较差异有统计学意义(t=7.869,P=0.0002)。CD106+MSCs亚群组趋化能力明显高于CD106-MSCs亚群组,其趋化细胞数分别为114.500±4.481、71.000±4.435,两组比较差异有统计学意义(t=6.900,P=0.0005)。CD106+MSCs亚群组较CD106-MSCs亚群组被诱导向成骨分化增强而向成脂分化减弱。CD106+MSCs亚群组衰老细胞和衰老蛋白p21的表达较CD106-MSCs亚群组更少,β-半乳糖苷酶染色检测P5代MSCs分选出的CD106+MSCs亚群组未见着色细胞,而CD106-MSCs亚群组则出现少量绿色着色细胞;其衰老蛋白p21在CD106+MSCs亚群组表达率明显低于CD106-MSCs亚群组[(17.560±1.421)%比(45.800±2.569)%,t=9.618,P=0.0000]。而用TNF-α刺激MSCs 0.5 h,CD106^+MSCs亚群组胞内NF-κB入核率明显高于CD106-MSCs亚群组[(37.780±3.268)%比(7.30±1.25)%,t=8.713,P=0.0001]。结论人骨髓CD106+MSCs亚群比CD106-MSCs亚群在骨髓微环境中展示了更强的生物学功能活力。

非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究

诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用。非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的最佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用。本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础。利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化。结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8 d,使用启动子为SFFV(spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3%)条件下诱导,CB MNC重编程效率最高,可达到0.12%。通过分析最佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+CD71+CD235alow的有核红细胞是重编程最主要的供体细胞来源。结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术。

拉曼光谱技术在肾脏病变鉴别诊断的应用进展

老年人群肾脏疾病患病率正在逐年升高,肾脏具有维持内环境稳定及内分泌功能,肾脏功能受损可引起各系统症状,目前肾脏疾病检查主要包括尿液检查、肾功能检查、影像学检查和肾脏病理学检查等,但由于其通常起病隐匿,早期诊断仍存在一定困难。临床研究中不断探索合适的肾脏标志物、检查方式以期能更早发现肾脏病变。随着拉曼光谱技术的发展,其可用于评估生物组织或液体的分子组成,从而获取具有诊断价值的定性或定量信息,并因其无创性等优点,在早期临床诊断方面表现出巨大潜力。本文就拉曼光谱技术在肾脏疾病诊断方面的应用及潜力作一综述。

基于流式细胞术和生物信息学技术的AML患者骨髓细胞代谢分析研究

目的:探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓细胞中的细胞类型分布和代谢情况,从代谢相关基因的表达水平角度对AML患者和健康者骨髓细胞的代谢特征进行对比分析。方法:使用流式细胞分析仪对AML患者的骨髓进行流式细胞分析,从美国国立生物技术信息中心数据库获取健康者和AML患者骨髓细胞的表达谱数据,应用t-分布邻域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)算法、统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection,UMAP)算法和基于快速傅里叶变换加速插值的t-SNE(about fast Fourier transform-accelerated interpolation-based t-SNE,Flt-SNE)算法3种生物信息学方法对流式数据进行降维分析,并使用SeqGeq^(TM)测序软件分析代谢相关基因的表达情况。结果:t-SNE算法、UMAP算法和Flt-SNE算法可将AML患者的骨髓细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和AML细胞4个类群。与健康者相比,AML患者的醛缩酶B(ALDOB)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)和琥珀酸脱氢酶B(SDHB)等糖代谢相关基因的表达水平偏高,脂代谢相关基因脂蛋白脂肪酶(LPL)、髓过氧化物酶(MPO)和视黄酸受体α(RARA)的表达水平明显偏低,肿瘤相关基因RET的表达水平偏高。结论:流式细胞术结合生物信息学技术可以很好地识别AML患者骨髓细胞的类群,揭示AML患者和健康者骨髓细胞的代谢相关基因表达水平的差异,为探索AML发病机制和研发以代谢为靶点的相关药物奠定基础。

光路系统的优化配置在多色流式细胞术实验方案设计中的应用

目的:基于流式细胞仪光路系统的硬件配置情况,探讨多色流式细胞术实验方案的优化设计。方法:选用6~8周B6小鼠的骨髓细胞作为实验材料,在已有流式抗体的基础上,通过变更BD AriaⅢ流式细胞仪中的滤光片,分别检测各荧光通道信号的相对变异系数%rCV和荧光强度中位值(median of fluorescence intensity,MFI)以及小鼠骨髓中的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)、造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)和多能祖细胞(multipotent progenitor cell,MPP)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果:通过优化光路系统配置,滤光片变更前后各荧光通道的%rCV无明显差异;HSC、HPC、MPP等细胞亚群在PerCP-Cy5.5通道的MFI(ROS水平)均增大;各亚群PerCP-Cy5.5通道的荧光信号(ROS水平)整体右移,实现了多参数流式分析。结论:在多色流式细胞术实验方案设计中,如相关荧光素抗体搭配受限,可通过灵活搭配使用流式细胞仪中的滤光片,合理优化光路系统的硬件配置,达到完成多色流式细胞术检测的目的。

运用Volocity软件分析T细胞与树突状细胞的动态相互作用

目的:使用高灵敏图像处理软件Volocity分析T细胞和树突状细胞动态相互作用。方法:将磁珠分选后的CD3+T细胞和流式细胞仪分选后CD11c+MHCⅡ+的树突状细胞进行荧光标记,采用激光共聚焦显微镜在二维和三维水平成像后,使用Volocity软件分析两种细胞的动态相互作用。结果:使用Volocity软件分析了视野内T细胞和树突状细胞形态、接触体积和运动轨迹的变化趋势,统计了细胞接触时间,并比较手动分析和软件分析细胞运动轨迹的差异,显示两种细胞在30 min内发生了明显接触,促进后续免疫反应发生。结论:使用Volocity系统分析T细胞和树突状细胞动态相互作用,建立了两种细胞动态相互作用的方法。

新形势下高校大型科研仪器共享平台信息化管理建设的必要性与路径研究

该研究分析了在国家创新驱动高质量发展和信息化进程的新形势下,现阶段高校大型科研仪器共享平台信息化管理建设的必要性以及信息化管理建设的现状和不足,在此基础上,提出了大型科研仪器共享平台信息化管理建设的路径。这些路径包括明确信息化管理建设在大型科研仪器共享平台管理中的重要性,信息化管理建设中制度建立、人员管理、仪器设备管理、共享服务和研究生实验技能培养等。该研究旨在为推动解决国内现有大型科研仪器共享平台存在的信息化管理建设问题提供参考。

抑制Larp4b表达不影响小鼠Lin^-造血细胞集落形成能力

Larp4b是人类LARP家族中的一员,为广谱翻译因子,可结合RNA并促进mRNA的翻译。前期本实验室的研究工作提示白血病患者存在Larp4b基因表达变化。本研究检测Larp4b基因在造血各系细胞中的表达量,敲降Larp4b表达对Lin-造血细胞生物行为的影响。利用RT-PCR检测Larp4b基因在造血各系细胞中的表达,用病毒上清感染Lin-细胞,分选EGFP+细胞,PI染色法检测细胞周期,AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡,并进行集落形成实验(colony forming cell assay,CFC)。结果表明:Larp4b基因在造血各系细胞中表达不同,Larp4b基因在粒系和巨噬祖细胞(GMP)以及髓细胞(M)的表达较高,在T淋巴细胞中表达明显低,抑制Larp4b表达不影响Lin-造血细胞体外集落形成能力,不影响Lin-造血细胞的细胞周期和凋亡。结论:Larp4b基因在髓系细胞中表达较高。抑制Larp4b表达不影响Lin-造血细胞集落形成能力,不影响Lin-造血细胞的增殖,这为后续Larp4b体内实验研究奠定了基础。