结肠癌细胞裂解物纳米疫苗的抗肿瘤作用研究

目的深入研究结肠癌肿瘤裂解物纳米疫苗的抗肿瘤作用。方法制备纳米化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(Cytosine guanine dinucleotide,CPG)佐剂并与结肠癌细胞系(MC38)细胞裂解物(lysate)组成纳米疫苗。体外培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),分4组进行BMDC的激活实验,分别为PBS组、空纳米颗粒(NP)组、溶解态CPG组和负载CPG的纳米颗粒(CNP)组。建立接种MC38肿瘤细胞的C57BL/6结肠癌荷瘤小鼠模型,肿瘤体积增至50 mm^(3)时分为4个免疫组,即PBS组、MC38细胞裂解物(lysate)组、CNP组和MC38细胞裂解物辅以CNP而成的疫苗(vaccine)组。每隔7 d进行皮下免疫,共免疫3次。最后一次免疫3 d后检测小鼠外周血、脾脏、腹股沟淋巴结T淋巴细胞比例及血清TNF-α、IFN-γ含量。结果经CNP处理的BMDC成熟比例提高(P<0.01)且分泌大量细胞因子(P<0.0001),MC38肿瘤裂解物纳米疫苗免疫荷瘤小鼠后肿瘤体积明显小于其他组(P<0.0001),同时外周血T淋巴细胞、脾脏T淋巴细胞、淋巴结T淋巴细胞比例明显提高(P<0.05),血清中细胞因子含量亦明显增加(P<0.05)。结论MC38肿瘤裂解物纳米疫苗可以有效激活树突状细胞(DC),诱导肿瘤特异性细胞免疫应答,发挥显著的抗肿瘤作用。

纳米肿瘤疫苗抗小鼠黑色素瘤的免疫效果

目的 研究基于纳米复合佐剂[包载CpG的纳米颗粒(CpG-coated nanoparticles,CNP)]及黑色素瘤细胞裂解物抗原的纳米肿瘤疫苗的抗黑色素瘤免疫效果。方法 检测CNP及黑色素瘤细胞裂解物抗原对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)的免疫调控作用及其对细胞因子IL-6和IL-12表达分泌的调控作用。接种黑色素瘤细胞的小鼠成瘤后,选择肿瘤体积相近的40只雌性C57BL/6N小鼠随机分为4组:对照(PBS)、佐剂(CNP)、裂解液(Lysate)和疫苗(CNP+Lysate)组,按皮下接种方式给药,1周1次,给药3周;每3 d记录小鼠肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线;收集小鼠外周血检测IFN-γ和TNF-α含量;免疫组化法检测CD8^(+)T淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润情况。结果 与PBS、CpG和肿瘤裂解物抗原组相比,纳米疫苗佐剂CNP能有效刺激BMDCs成熟,促进IL-6和IL-12分泌;接种纳米肿瘤疫苗显示出较好的体内抗肿瘤活性,疫苗组小鼠肿瘤体积明显减小,其血清中IFNγ和TNF-α分泌水平显著高于其他组;疫苗组小鼠肿瘤中CD8^(+)T淋巴细胞浸润情况也明显优于其他组。结论 纳米肿瘤疫苗能有效激活BMDCs并高表达免疫因子,也能有效抑制肿瘤生长,显示出良好的应用潜质。

肿瘤疫苗在结肠癌模型小鼠体内抑制效果的评价

目的评价肿瘤疫苗在结肠癌模型小鼠体内的抑制效果。方法用CpG的β-葡聚糖纳米颗粒(CpGβ-glucan nanoparticles,CNP)于体外刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs),同时设PBS组、NP组(无CpG纳米颗粒)、Lysate组(MC38细胞裂解物)及CpG组(CpG1826),流式细胞术检测BMDCs表面标志分子的表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-12p40的含量。将50 mg/mL肿瘤裂解物(MC38细胞裂解物)与200 mg/mL的CNP按1∶1的体积比混合,制备成肿瘤裂解物纳米疫苗。用该疫苗经皮下免疫C57BL/6J小鼠(Vaccine组),同时设PBS组、CNP组及Lysate组,每周1次,共免疫3次,末次免疫后1 h,经小鼠右下肢皮下接种MC38细胞,2×10^(5)个/只,每3 d测量1次肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线;流式细胞术分析小鼠血液中CD3^(+)CD4^(+)T及CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例;ELISA法检测小鼠血液和脾脏中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干扰素γ(interferonγ,IFNγ)的含量。结果CNP在体外提高BMDCs表面标志物CD11c^(+)CD80^(+)、CD11c^(+)CD86^(+)、CD11c^(+)MHC-Ⅱ^(+)的表达及IL-6和IL-12p40的分泌水平明显高于其他4组(t=4.3~46.2,P均<0.05)。与其他3组比较,Vaccine组小鼠肿瘤体积明显减小(t=2.6~3.4,P均<0.05);CD3^(+)CD8^(+)T及CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例差异均无统计学意义(t=0.5~1.9,P均>0.05);血液中IFNγ含量明显升高(t=3.8~4.6,P均<0.05),TNF-α含量差异无统计学意义(t=0.4~2.0,P均>0.05);脾脏中IFNγ及TNF-α含量均明显升高(t=6.3~13.0,P均<0.001)。结论制备的肿瘤裂解物纳米疫苗能提高小鼠体内免疫水平,有效抑制结肠癌生长。

新型锰佐剂联合肿瘤抗原抗肿瘤效果评价

目的 探讨新型环状鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)/干扰素基因刺激(stimulator of interferon genes,STING)通路激动剂MnCl_(2)联合肿瘤细胞裂解物(Lysate)和小鼠结肠癌MC38细胞系新抗原10K-Adpgk的抗肿瘤效果。方法 从小鼠骨髓提取骨髓来源树突细胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC),分为3组:PBS、1μmol/L MnCl_(2)和10μmol/L MnCl_(2)组,流式细胞术分析BMDC成熟情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6浓度,q PCR法检测BMDC中相关IL-6、IFN-α、IFNβ、CXCL9基因转录水平。采用MC38细胞系建立小鼠肿瘤模型,当肿瘤体积达100 mm3时,随机分为PBS、Lysate、MnCl_(2)、10K-Adpgk、Lysate+MnCl_(2)组以及Lysate+10K-Adpgk+MnCl_(2)联合治疗组,均经尾部皮下给药,共给药3次,每次间隔1周,期间每2 d测量肿瘤体积,最后1次给药后1周,眼眶取血,分离血清,ELISA法检测IFNγ和TNF-α浓度;分离小鼠肿瘤及脾脏,流式细胞术检测外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中T细胞、肿瘤浸润性T细胞及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例,ELISPOT试验检测脾脏中抗原特异性T细胞比例。结果 10μmol/L MnCl_(2)可刺激BMDC成熟,激活后续免疫过程。联合治疗组小鼠肿瘤体积远小于PBS组,血清中IFNγ和TNF-α含量高于其他组,肿瘤浸润性T细胞、PBMC中T细胞以及脾脏中T细胞与记忆性T细胞比例与PBS组相比,也明显升高。联合治疗可引起强烈的抗原特异性T细胞免疫反应。结论 新型佐剂MnCl_(2)的加入显著增强了肿瘤细胞裂解物和新抗原的治疗效果,为开发基于MnCl_(2)以及肿瘤抗原联合治疗肿瘤的方法提供了实验依据。