来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶基因lacO进行了分子改造。改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。PCR检测、SDS—PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明，lacM基因已重组到酵母染色体上，并能正常分泌表达。与来改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比，酶蛋白表达量明显增加，约为改造前的3倍以上。

有机磷农药降解酶及其基因工程研究进展

有机磷农药是国内外使用最广泛的农药之一 ,为农业丰收做出了很大贡献。但是 ,有机磷农药具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能 ,对人存在着程度不同的毒性。有机磷农药降解酶可降解有机磷农药分子 ,破坏有机磷农药的磷酯键而使其脱毒。综述了有机磷农药降解酶及其特性 ,以及相关基因的分离克隆和基因工程研究进展。

绵羊干扰素tau在毕赤酵母中的表达

应用绵羊的干扰素tau基因IFNt,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好进行分子改造。改造后的基因IFNt克隆到毕赤酵母表达载体p PIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒p PIC9-IFNt。电转化于毕赤酵母GS115菌株,对转化后菌体诱导表达,上清SDS-PAGE检测,并优化诱导表达条件。结果表明:IFNt基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达,最佳诱导条件为:200 r/min,28℃,0.5%甲醇,96 h。该研究为真核表达绵羊IFNt的生产应用提供了一定的理论依据。

重组人干扰素α2b的制备研究

为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺。采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×10^8IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。

重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究

为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率,首先合成了胰岛素原基因,并在其序列的N端引入了一段引导肽,构建成p PICZα-A-Pro-INS重组分泌型表达载体。将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母GSll5感受态细胞,筛选获得分泌型高表达工程菌株,重组蛋白的表达水平为300 mg/L,占分泌总蛋白的40%左右。该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表达胰岛素的基因至关重要。

用纳米传感器诊断早期肺癌的研究进展

肺癌是世界范围内造成死亡的恶性肿瘤之一。早期识别不仅有助于检测原发癌,而且能监测肿瘤发展进程以评估风险。目前可用的诊断方法昂贵或具有侵入性,并不适于普遍筛查。非侵入性诊断技术用于监测癌症的发展仍是一个难题。基于呼气生物标志物的挥发性化合物(VOC)可用于分析患者的呼吸。本文回顾了各种VOC分析方法,包括使用最新的金纳米粒子检测VOC。该技术适于早期发现肺癌,高度准确,相对容易操作,显示出作为一种非侵入性和具有成本效益的诊断技术的巨大潜力。

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表 明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.

一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究

从农药厂被污染的土壤中分离到一株降解有机磷农药的高效菌株C2-1,经鉴定表明为假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes).对其产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离和纯化,并对其酶学性质进行了研究.其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃,最适pH为9,并且此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,对大多数金属离子和化学试剂不敏感.OPHC2氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分析表明,OPHC2与目前发表的有机磷降解酶没有同源性.

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的:人精氨酸酶(Arginase,Arg)的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法:将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果:成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310IU/mg。结论:成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。