小黑杨bHLH转录因子基因和启动子的克隆与分析

为了研究木本植物中同源bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子的功能,以小黑杨为研究对象,参照毛果杨序列设计引物进行PCR。获得了2条bHLH转录因子基因以及其上游部分启动子序列,将获得的基因命名为PxbHLH01和PxbHLH02,并对这2个基因进行了详细的生物信息学分析。多序列比对结果表明,与拟南芥编码bHLH转录因子UPBEAT1有较高同源性。系统进化树表明与毛果杨和拟南芥等同源基因亲缘关系较近。启动子顺式调控元件分析结果表明,其启动子区包含有氧应答及其它胁迫相关元件,其功能可能与植物活性氧代谢以及胁迫耐受相关。

硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1-copia类逆转座子的克隆及分析

利用Tvl—copia类逆转座子逆转录酶（RT）的保守区域设计引物，优化了扩增条件后利用RT—PCR从白桦愈伤组织中得到了1条逆转录酶序列。利用硝普钠（SNP）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后分别扩增克隆了11条和9条逆转录酶序列。这2l条逆转录酶序列（命名Bprtl-21）变化范围为205—290bp，一致性为71．93％，异质性为1．1％。50．9％，翻译成氨基酸的异质性为0～57．1％。经SNP和MeJA处理的样品中，获得的逆转录酶序列基本是分别聚类．初步证明不同的Tvl-copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。分析所获得的21逆转录酶序列和苹果中19务逆转录转座子序列（DQ410748-DQ410766）进化关系发现．逆转录酶基本各自聚类。但是Bprt9、Bprtll和OQ4m750进化关系比较接近，Bprt15、Bprt19、DQ410751和DQ410753聚为一类，证明逆转座子存在水平传递。

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4℃低温、盐(Na Cl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。

水曲柳FmABI5基因非生物胁迫及信号诱导的表达模式分析

ABI5(abscisic acid-insensitive 5)蛋白是一个响应ABA信号的碱性亮氨酸拉链类(basic leucine zipper,b ZIP)转录因子。揭示了水曲柳FmABI5在非生物胁迫下的表达特征,为该基因在水曲柳中代谢调控功能的研究奠定基础。获得了水曲柳ABI5基因的全长,命名为FmABI5,应用生物信息学软件分析了水曲柳FmABI5基因的分子结构特征,利用PEG、低温(4℃)及盐(NaCl)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)进行信号诱导,分析FmABI5的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 455 bp,含有完整的开放阅读框,编码484个氨基酸。FmABI5为不稳定类亲水性蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,α-螺旋、延伸链、无规则卷曲分布于整个蛋白。分子进化分析结果表明,水曲柳FmABI5基因与芝麻的遗传距离较近,说明其亲缘关系较近;与马铃薯、潘那利番茄、水茄与甜椒的遗传距离较远,说明其亲缘关系较远。非生物胁迫结果表明,FmABI5基因表达水平随非生物胁迫处理时间不同而上下波动,但在处理6、48和72 h后,FmABI5基因对3种非生物胁迫处理都上调表达,说明FmABI5基因对非生物胁迫具有响应。信号诱导结果表明,外源的ABA与GA共同调节了FmABI5基因的表达。

水曲柳结构域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析

[目的]克隆并分析水曲柳结构域重新甲基化酶(DRM)基因片段。[方法]根据GenBank上已发表的DRM氨基酸序列,采取CODEHOP方法设计合成1对简并引物,采用RT-PCR技术对水曲柳DRM基因进行扩增,将PCR产物与pMD 18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析。[结果]克隆得到的DRM基因cDNA序列长802 bp,由267个氨基酸残基组成,命名为FmadrmA。序列比对表明FmadrmA与参考的12个物种的DRM在氨基酸水平上表现出较高的同源性,其与山葡萄、番茄、黄瓜、野草莓、大豆、苜蓿、玉米、烟草、拟南芥、毛果杨、水稻和乌拉尔图小麦的DRM同源性分别为61%、54%、51%、50%、60%、48%、43%、44%、37%、42%、42%和39%。系统进化树分析表明同源的DRM蛋白可大致聚为3类,而水曲柳与其他植物的亲缘关系较远。[结论]该试验成功获得了水曲柳FmadrmA基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步研究结构域重新甲基化酶基因及分析其表达特性奠定了基础。

水曲柳SnRK2B基因和启动子的克隆及分析

为了研究水曲柳中同源SnRK2转录因子的功能,在水曲柳干旱响应转录组中寻得SnRK2B的同源序列并克隆得到SnRK2B转录因子基因全长,将其命名为FmSnRK2B。使用SiteFinding-PCR法扩增获得SnRK2B启动子序列,并对FmSnRK2B基因编码区及其启动子进行生物信息学分析和启动子顺式调控元件分析。结果表明,克隆得到的全长序列包含完整的开放阅读框1074bp,编码357个氨基酸。启动子顺式作用元件分析结果表明,其启动子区包含脱落酸应答元件ABRE及胁迫相关元件HSE、MBS等。干旱胁迫下,FmSnRK2B基因的表达随胁迫时间的延长先增加后降低,表明其参与植株的抗逆过程。本研究对进一步揭示水曲柳的抗逆机制具有重要意义。

水曲柳FmPIF基因家族克隆及表达模式分析

【目的】探究水曲柳光敏色素互作因子(FmPIFs)在激素调控与非生物胁迫应答过程中的重要作用,为揭示水曲柳抗逆分子机制和制定林木遗传育种策略提供理论依据。【方法】在水曲柳中克隆FmPIFs基因,并对其基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、系统进化关系等进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法分析水曲柳中FmPIFs基因在不同组织及不同激素与胁迫条件下的表达模式。【结果】获得5个水曲柳FmPIFs基因家族成员,分别命名为FmPIF1、FmPIF3、FmPIF4、FmPIF7和FmPIF8,其对应的蛋白均为亲水性不稳定蛋白,全部定位在细胞核内。多序列比对结果表明FmPIFs均存在APB保守结构域,成员FmPIF1与FmPIF3存在特有的APA结构域。组织特异性分析显示FmPIFs均在叶中表达量最高,其中成员FmPIF8表达量最高,为对照的3.96倍;但在茎中少量表达,茎中表达量最高的是FmPIF3,仅是对照的0.21倍;而在根中表达量均极低。胁迫响应分析表明,FmPIFs正调控水曲柳植株盐、碱和干旱胁迫抗性,而对植株抗寒性起负调控作用,其中成员FmPIF3对寒冷及盐胁迫明显响应,FmPIF8在碱胁迫下表达量明显上调,FmPIF1在干旱胁迫下表达量明显上调。在激素响应结果中,FmPIFs对脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和赤霉素(GA_(3))的响应较为一致,而对生长素(IAA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的响应存在差异。FmPIF1在施加MeJA后剧烈应答且表达量显著上调,FmPIF7在SA处理后表达量明显上调,FmPIF3和FmPIF4在GA3处理后表达量明显上调。【结论】FmPIFs各成员在基因及蛋白结构上表现出较高的一致性。RT-qPCR结果表明,FmPIFs在水曲柳叶片中表达量最高。在盐、碱、干旱和寒冷胁迫下,FmPIFs被诱导表达,且大部分表达模式相似。FmPIFs也在水曲柳响应IAA、ABA、MeJA、SA、GA3激素调控过程中发挥重要作用。

水曲柳FmNAC072基因克隆及表达模式分析

研究水曲柳FmNAC072基因在非生物胁迫及激素信号诱导下的表达特征,为深入分析FmNAC072基因功能提供参考。以水曲柳叶片为材料,用PCR法克隆目的基因,采用生物信息学软件分析其分子结构特征。通过荧光定量PCR研究FmNAC072基因在低温、盐非生物胁迫及ABA、IAA、GA 3、JA及SA激素诱导下的表达模式,并分析其时空表达特异性。结果表明,水曲柳NAC072基因序列为FmNAC072。该基因全长1011bp,含完整的开放阅读框,编码336个氨基酸。生物信息学分析表明FmNAC072为亲水性稳定蛋白,α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分布整个蛋白,亚细胞定位预测在细胞核中,与樟子松的蛋白序列具有很高同源性。非生物胁迫处理及激素诱导下,FmNAC072基因表达量与对照组相比差异显著。时空表达检测中,FmNAC072基因在根表达量最高,5月份FmNAC072基因表达量达峰值。FmNAC072基因参与植物生长发育及逆境胁迫的平衡。

水曲柳CUC1基因克隆及瞬时表达分析

[目的]本研究克隆了水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)CUC1基因,分析其表达特性,为该基因在水曲柳再生的调控研究中奠定基础。[方法]从水曲柳苗克隆FmCUC1基因,利用生物信息学软件分析Fm-CUC1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因转入洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位,通过实时荧光定量分析FmCUC1基因在根、茎、叶、顶芽的组织表达特异性及FmCUC1基因在下胚轴芽再生与种子萌发过程中的差异表达;同时对水曲柳幼苗喷施IAA、6-BA、BR激素处理,分析FmCUC1基因在不同激素信号诱导下的表达模式;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因瞬时转化水曲柳72 h后,分析其通路相关基因表达情况。[结果]克隆得到FmCUC1基因全长807 bp,编码269个氨基酸,FmCUC1为稳定疏水蛋白,含有保守的NAC-domain蛋白结构域;FmCUC1蛋白与同科的木犀榄蛋白序列相似性为86.17%,亲缘关系较近;FmCUC1蛋白定位于细胞核上。qRT-PCR分析表明:FmCUC1基因在水曲柳的顶芽中表达量最高;在下胚轴芽再生过程中,FmCUC1基因在芽点产生与丛枝形成期均高表达;在水曲柳种子萌发过程中,FmCUC1基因分别在第4天和第8天分别达到两个峰值,为第0天的8.56倍和8.46倍。外源喷施IAA、6-BA、BR激素处理结果显示,FmCUC1基因表达量与对照相比均呈现上调表达,在IAA、BR处理72 h后均达到最高值,分别为对照的45.72倍和20.36倍;在6-BA处理48 h达到峰值,为对照59.40倍。利用农杆菌介导水曲柳FmCUC1基因瞬时过表达72 h后,该基因表达量显著上调,且其下游STM基因的表达量也明显上升。[结论]FmCUC1基因属于NAC家族转录因子,参与水曲柳芽再生过程,响应了IAA、6-BA、BR植物激素信号诱导,过表达FmCUC1基因可激活其下游STM基因的表达,进而有利于顶端分生组织的形成;为进一步研究CUC1基因在水曲柳芽再生过程中的作用机制奠定基础,也为今后水曲柳转基因工作提供新思路。

水曲柳FmPLT基因家族的鉴定及表达分析

【目的】PLT转录因子家族能够参与植物的再生过程,并且在植物的生长发育及器官建成中发挥着重要作用,本研究旨在探究PLT转录因子在水曲柳生长发育及非生物胁迫中发挥的作用,以期为林木优良基因选育工作提供更多思路。【方法】通过同源序列比对和基因克隆等方法对FmPLTs家族的成员进行鉴定及分析,之后对FmPLTs成员进行了详细的生物信息学分析,包括理化性质、系统进化关系和基因结构等;并进一步分析了FmPLTs成员在不同组织及种子萌发过程中的基因表达特征,以及其在非生物胁迫(氯化钠、聚乙二醇6000、碳酸氢钠和低温4℃)和植物激素处理脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸和茉莉酸甲酯下的诱导表达情况。【结果】水曲柳基因组中含有9个PLT基因家族成员,分别命名为FmPLT2、FmPLT3、FmPLT4、FmPLT4A、FmPLT5、FmPLT5A、FmPLT7、FmPLT8和FmPLT9。系统进化关系将其分为5组;其在根中表达量最高,在叶中表达量最低;在种子萌发第4天子叶变绿,下胚轴伸长,此时FmPLTs成员的表达量出现峰值;而在不同激素及非生物胁迫条件下,FmPLTs对低温、干旱、盐胁迫以及MeJA的处理响应明显。【结论】FmPLTs参与水曲柳种子萌发及器官发育,并能响应植物激素信号,同时积极参与植物非生物胁迫耐受性的调控,包括低温、高盐和干旱胁迫等;本研究初步揭示了水曲柳FmPLT家族成员响应植物激素和非生物胁迫的表达模式,同时为深入分析FmPLT基因家族基本功能及其调控机制奠定了基础。

水曲柳 FmPHV 基因克隆及在形成层愈伤组织中的表达分析

该研究通过基因克隆获得了水曲柳PHV基因,并命名为FmPHV。生物信息学分析表明,水曲柳FmPHV基因编码区全长为2112 bp,包含有一个完整的开放阅读框,其编码了一个由703个氨基酸组成的蛋白。亚细胞定位预测其主要存在于叶绿体中,为稳定亲水蛋白。保守域及同源分析表明,FmPHV与油橄榄、芝麻和烟草等物种的同源蛋白保守结构域同源性高达99%。在低温4℃条件下,使用50 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)溶液对水曲柳树皮进行处理,获得了水曲柳形成层细胞,并进一步诱导获得形成层愈伤组织。对FmPHV基因的时空表达模式进行分析表明,FmPHV基因6月表达量最高,同时FmPHV能在芽中高表达,通过树皮获得的不同来源的愈伤组织相互比较可知,FmPHV在来源为形成层分生组织形成层愈伤组织中的表达量显著高于其在其他来源的愈伤组织中的表达。此外,对水曲柳幼苗瞬时过表达FmPHV基因,对其所在通路关键基因的表达特征进行分析,FmPHV瞬时过表达后,生长素相关基因表达下降,细胞分裂素相关基因表达上升,有利于芽的分化。以上结果表明,揭示了水曲柳FmPHV在水曲柳植株生长过程中的表达模式以及FmPHV过表达对芽再生通路各关键基因的调控情况,为研究水曲柳FmPHV调控生长发育的分子机制以及其在生长素和细胞分裂素响应通路中发挥的作用奠定基础。

5个新品系香蕉的果实品质分析及模糊综合评判

为了能够客观地筛选出综合品质优良的香蕉新品系,对新育成的5个香蕉新品系XF1、XF2、XF3、XF4和XF5的果实品质进行了果实品质分析及模糊综合评判。对5个香蕉新品系果实的主要感官品质指标(包括色泽、香味、口感、伤病虫害以及脱柄情况)和内在品质指标(包括可溶性固形、维生素C、可溶性总糖、总可滴定酸、单宁以及糖酸比)进行了测定、评分以及比较,同时建立了感官品质指标与内在品质指标间的相关性,并结合模糊综合评判中的综合隶属函数法,对这5个香蕉新品系按综合隶属函数值大小进行优劣排名,排名越高,说明其综合品质越好,反之越差。研究结果表明:XF2在综合隶属函数值的排名中位次最高,说明其综合品质最好,可作为主推品系,因为其具有糖酸比高、可滴定酸含量低以及果肉软糯无酸味等特点,也可以作为独特风味品种推广;XF1在综合隶属函数值排名中,仅次于XF2,排名第2位,说明其综合品质相对于XF2较劣,但其外观品质是5个香蕉新品系中表现最好(果皮表现为金黄色,与其他品系相差一个评级),可以选择外观这一特性作为特色品种推广;XF4和XF5在综合隶属函数值中排名分别为第3名和第4名,它们的各项指标相差不大,在5个香蕉新品系中,其综合品质表现较劣,但是它们的各个品质指标(评分)相对平稳,因此也可以考虑作为一般品种推广;XF3在综合隶属函数值中排名第5名,说明其综合品质最劣,因其具有较高的总可滴定酸含量,也为香蕉提供了独特风味的选择。

水曲柳丙二烯氧化物合成酶基因FmAOS序列与表达模式分析

茉莉酸(jasmonic acid,JA)作为一种重要的信号分子参与了植物的生长发育过程,JA生物合成途径中的关键酶为丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)。本研究克隆了水曲柳(Fraxinus mandschurica)AOS基因,命名为Fm AOS。生物信息学分析表明该基因全长1 605 bp,具有完整的开放阅读框,编码534个氨基酸。Fm AOS为两性不稳定性蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测其存在于叶绿体中。三维建模分析表明该蛋白属于混和型。Fm AOS表达模式分析表明,其响应了寒冷、Na Cl、干旱等非生物胁迫及脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)等植物激素信号,但表达模式各不相同,说明Fm AOS参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。本文为Fm AOS功能的深入研究提供参考。

水曲柳WRKY40基因的克隆及表达模式分析

从水曲柳中克隆一个WRKY基因,序列比对后命名为Fm WRKY40,基因编码区全长为936 bp,编码331个氨基酸(GenBank登录号:KU928310);含有一个WRKY保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅱ类成员;分子进化分析表明,Fm WRKY40与芝麻WRKY40亲缘关系最近,蛋白相似性为73%;qRT-PCR表达模式分析表明:Fm WRKY40在干旱胁迫和ABA(脱落酸)胁迫下明显上调表达,该基因在水曲柳应答干旱和其他非生物胁迫中可能起重要的调控作用。

白桦BpHMGR基因的结构及表达模式分析

目的研究白桦Betula platyphylla 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-Co A reductase,Bp HMGR)全长基因结构特征及编码蛋白性质,揭示其节律表达模式以及对外源NO信号分子的响应机制。方法通过RACE技术克隆白桦Bp HMGR基因,应用生物信息学软件对Bp HMGR及其编码蛋白进行详细分析,利用实时荧光定量PCR定量分析Bp HMGR基因在昼夜节律变化中的表达模式。根据Bp HMGR氨基酸序列构建系统进化树,分析昼夜节律以及外源NO对白桦叶片中Bp HMGR转录水平的影响。结果 Bp HMGR基因全长1 764 bp,包含完整开放阅读框,已上传至NCBI,并获得登录号KJ452334,其编码蛋白由587 aa组成。白桦Bp HMGR基因与大豆(XP_003519474.1)、葡萄(XP_002275827.1)、苜蓿(XP_003617066.1)亲缘关系较近。结论 Bp HMGR随昼夜周期变化呈现出节律表达特性,在夜晚21:00时达到峰值。初步揭示了外源NO能诱导白桦细胞内三萜代谢途径的关键酶Bp HMGR基因上调表达,进而促进三萜产物齐墩果酸的合成。