QRICH1介导NF-κB p65调控Bcl-2、Bax在砷致肝癌细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨砷(AS)诱导肝癌细胞凋亡过程中QRICH1通过调控NF-κB p65表达水平调控Bcl-2、Bax的作用机制。方法:体外培养人的肝癌细胞(HepG2细胞),采用慢病毒转染的方式,构建过表达/敲低QRICH1稳定表达HepG2细胞株。分为对照组、加砷组、砷+QRICH1过表达阴性对照组、砷+QRICH1过表达组、砷+QRICH1敲低阴性对照组、砷+QRICH1敲低组。在细胞对数生长期时,加入40μmol/L亚砷酸钠(NaAsO_(2))作为终浓度处理24 h。对照组加入与NaAsO_(2)同等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理。采用细胞计数(CCK-8)检测细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞QRICH1、NF-κB p65及Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:CCK-8结果显示与对照组比较,砷处理组增殖率比例明显降低(P<0.05);与砷+QRICH1过表达阴性对照组比较,砷+QRICH1过表达组细胞增殖率明显上升(P<0.05),与砷+QRICH1敲低阴性对照组比较,砷+QRICH1敲低组细胞增殖率明显下降(P<0.05),差异具有统计学意义。流式细胞术结果显示与对照组比较,砷处理组总凋亡率比例明显升高(P<0.05);与砷+QRICH1过表达阴性对照组比较,砷+QRICH1过表达组细胞总凋亡率比例明显下降(P<0.05),与砷+QRICH1敲低阴性对照组比较,砷+QRICH1敲低组细胞总凋亡率比例明显上升(P<0.05)。蛋白免疫印迹法结果显示与对照组比较,砷处理组QRICH1、NF-κB p65及Bcl-2蛋白表达水平较低,Bax的蛋白表达水平较高(P<0.05)。与砷+QRICH1过表达阴性对照组比较,砷+QRICH1过表达组QRICH1、NF-κB p65及Bcl-2蛋白表达水平较高,Bax的蛋白表达水平较低(P<0.05)。与砷+QRICH1敲低阴性对照组比较,砷+QRICH1敲低组QRICH1、NF-κB p65及Bcl-2蛋白表达水平较低,Bax的蛋白表达水平较高(P<0.05),差异具有统计学意义。结论:砷致HepG2凋亡过程中,QRICH1通过调节NF-κB p65的表达,进而影响了Bcl-2、Bax的表达。提示QRICH1可能是促进肝癌细胞凋亡的潜在作用靶点。

二硫苏糖醇抑制序列相似性家族134成员B(FAM134B)介导的内质网自噬促进大鼠肝细胞凋亡

目的探讨序列相似性家族134成员B(FAM134B)介导的内质网自噬在内质网应激(ERS)诱导的肝细胞凋亡中的作用及分子机制。方法采用(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0)mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)处理BRL-3A大鼠肝细胞48 h,实时无标记细胞动态分析(RTCA)检测肝细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测ERS及内质网自噬相关蛋白、内质网-线粒体接触位点相关蛋白及线粒体凋亡途经相关蛋白表达的影响。内质网及溶酶体的荧光探针检测DTT处理细胞后二者的荧光共定位;线粒体钙离子荧光探针罗丹明2乙酰氧基甲酯(Rhod-2 AM)检测DTT对线粒体中钙离子水平的影响。结果DTT可显著抑制肝细胞的增殖并促进细胞凋亡。DTT处理肝细胞后ERS及内质网自噬相关蛋白、内质网-线粒体接触位点相关蛋白及线粒体凋亡途经相关蛋白的表达均显著上调。DTT处理细胞后内质网和溶酶体的荧光共定位显著减弱,同时,线粒体内钙离子荧光强度明显增强。结论DTT通过抑制FAM134B介导的内质网自噬,进而增加线粒体内Ca^(2+)的水平,促进肝细胞凋亡。

钙蛋白酶2及自噬相关蛋白5对内质网应激诱导的肝细胞凋亡的影响

目的:探讨二硫苏糖醇(DTT)诱导大鼠正常肝细胞BRL-3A发生内质网应激(ERS)过程中钙蛋白酶2(calpain-2)及自噬相关蛋白5(Atg5)对肝细胞凋亡的影响。方法:采用2.0 mmol/L DTT处理BRL-3A细胞0、6、12和24 h,诱导细胞发生ERS;实时无标记细胞分析仪(RTCA)检测DTT对BRL-3A细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;real-time PCR检测calpain-2和Atg5的m RNA表达;Western blot检测calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平的变化;免疫共沉淀(Co-IP)方法研究calpain-2与Atg5之间的相互作用。结果:不同浓度的DTT处理细胞后,细胞增殖受到显著抑制;流式细胞术检测凋亡发现,DTT处理BRL-3A细胞6、12和24 h后,细胞凋亡较0 h组显著增多(P<0.05)。流式细胞术检测细胞周期发现,DTT处理细胞后,细胞被阻滞在G1期(P<0.05)。DTT处理细胞6、12和24 h后,细胞中calpain-2和Atg5的m RNA表达水平较0 h组显著上调(P<0.05),calpain-2、Atg12和Atg7的蛋白水平也较0 h组显著升高,且LC3-II/LC3-I比值明显增大,而Atg5的表达较0 h组显著降低(P<0.05)。Co-IP发现,calpain-2抗体可以将Atg5蛋白从细胞裂解物中沉淀下来,Atg5抗体也可以将calpain-2从细胞裂解物中沉淀下来,证实calpain-2与Atg5之间存在相互作用。结论:calpain-2可能通过与Atg5之间的相互作用参与ERS诱导的肝细胞凋亡过程。

调控组蛋白H3K27me3水平对砷致肝细胞凋亡过程中BCL2表达的影响

目的探讨在砷诱导肝细胞凋亡过程中,组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)水平对抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(BCL2)基因表达的影响。方法体外培养大鼠肝细胞BRL-3A,根据砷处理因素将实验分为两部分,未染砷时分为正常、转染试剂、阴性转染、JMJD3(H3K27me3特异性去甲基化酶)小干扰RNA(siRNA)转染、EZH2(H3K27me3甲基转移酶)siRNA转染组;染砷时分为对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+JMJD3siRNA转染、砷+EZH2siRNA转染组。未染砷时siRNA和转染试剂按照100 pmol∶7.5μl比例转染细胞6 h[正常组加入与转染试剂同体积的磷酸盐缓冲液(PBS)],再换培养基培养,共48 h;染砷时同上述方法转染和培养细胞24 h,染砷各组再加入终浓度为30μmol/L的亚砷酸钠(NaAsO2)处理24 h(对照组加入与NaAsO2同体积的PBS处理24 h)。采用实时无标记细胞分析(RTCA)技术动态观察染砷时细胞增殖情况;流式细胞术检测染砷时细胞的凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测未染砷时和染砷时细胞JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀技术检测染砷时细胞BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平。结果对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+JMJD3siRNA转染、砷+EZH2siRNA转染组细胞增殖率分别为(100.00±10.43)%、(12.19±3.37)%、(31.86±1.95)%、(24.58±3.64)%、(11.53±1.11)%,细胞凋亡率分别为(1.15±0.04)%、(13.06±1.33)%、(17.39±0.22)%、(23.90±1.66)%、(15.07±0.88)%,组间比较差异均有统计学意义(F=146.50、194.30,P均<0.001)。JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平均高于正常、转染试剂、阴性转染组,EZH2siRNA转染组则相反(P均<0.05);JMJD3siRNA转染组BCL2蛋白表达水平均低于正常、转染试剂、阴性转染组,EZH2siRNA转染组则相反(P均<0.05),而在正常、转染试剂、阴性转染组之间,H3K27me3、BCL2蛋白表达水平均未见明显改变(P均>0.05)。在对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+JMJD3siRNA转染、砷+EZH2siRNA转染组之间,JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(F=26.56、7.82、9.81、31.19,P均<0.05)。与对照组比较,砷处理组JMJD3、EZH2蛋白表达水平均较低,H3K27me3蛋白表达水平较高,同时BCL2蛋白表达水平较低(P均<0.05);与砷+阴性转染组比较,砷+JMJD3siRNA转染组JMJD3蛋白表达水平较低,砷+EZH2siRNA转染组EZH2蛋白表达水平较低,砷+JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平较高,同时BCL2蛋白表达水平较低,而砷+EZH2siRNA转染组则相反(P均<0.05)。与对照组比较,砷处理组细胞BCL2基因启动子区(CHIP1、CHIP2)H3K27me3的富集水平均较高(P均<0.05)。结论砷通过增加BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平,进而抑制BCL2的表达,促进肝细胞凋亡。