基于CRISPR-Cas12a系统的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法的建立

为了建立一种特异性强、灵敏度高的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法,试验将聚合酶链式反应(PCR)与成簇的有规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated, CRISPR-Cas)系统相结合,首先根据鼠伤寒沙门氏菌的spy基因序列3′末端的保守区设计crRNA及靶标序列扩增引物,根据可视化检测原理设计单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)荧光报告探针;然后对靶标序列进行PCR扩增,将扩增产物加入CRISPR-Cas12a系统,在蓝光下通过肉眼观察是否产生绿色荧光实现对靶标的检测;最后进行特异性试验和灵敏度试验。结果表明:建立的方法仅能检测到鼠伤寒沙门氏菌,检测不到除鼠伤寒沙门氏菌外其他血清型的沙门氏菌及大肠杆菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌,能检测到循环数为14个的PCR产物和0.53 copies/μL的重组质粒,灵敏度优于常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法。说明本试验建立的方法可以实现鼠伤寒沙门氏菌的可视化检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。