基于氮掺杂碳点荧光猝灭法检测铜离子

作为一种新型的碳纳米材料,掺杂碳点具有量子产率高、可调的发光范围、良好的水溶性和生物相容性等优点,使其在环境、电子发光、生物成像和细胞标记等领域显示出广泛的应用前景。本课题组以柠檬酸为碳源,谷胱甘肽为氮源,用水热法成功合成了氮掺杂碳点,将其作为荧光探针用于微量铜离子的检测。

基于《内经》“病在脉,调之血”论动脉粥样硬化

动脉粥样硬化病变是多种心血管疾病的病理生理基础。以脏象学说为依据,从五脏出发,基于《内经》“病在脉,调之血”理论阐述动脉粥样硬化发病机制。探讨由于神志、饮食、居处调摄失司导致脏腑气虚,进而影响脏腑调控膏脂代谢、津液代谢及血的生成和运行环节,从而产生的痰瘀毒等病理产物,痰瘀毒邪蕴蓄于血,久而侵蚀脉管,最终脉管受损,产生动脉粥样硬化的过程。并为临床早期干预动脉硬化,及心血管疾病的未病先防提供参考。

高血糖诱导肝星状细胞5-羟色胺降解在2型糖尿病致肝脏炎症和纤维化时的作用

目的:探讨5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)引起肝脏炎症及纤维化时的作用。方法:雄性C57BL/6J小鼠,通过高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素,建立T2DM模型;将已形成高血糖的小鼠继续用高脂饲料喂养9周或同时用5-HT 2A受体(5-HT 2A receptor,5-HT 2A R)拮抗剂盐酸沙格雷酯(sarpogrelate hydrochloride,SH)及5-HT合成抑制剂卡比多巴(carbidopa,CDP)分别或联合给药进行治疗。细胞实验用人肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)株LX-2,高浓度葡萄糖刺激或同时用SH、CDP或单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)抑制剂氯吉兰(clorgyline,CGL)处理细胞,观察高糖诱导LX-2细胞肌成纤维细胞化时5-HT的作用。用苏木精-伊红(hematoxylin&eosin,HE)及马松(Masson)染色法检测肝组织切片病理变化,免疫组织化学及Western blot分析蛋白表达,ELISA或酶试剂法检测生化指标,荧光探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。结果:T2DM小鼠肝脏的5-HT 2A R、5-HT合成酶和MAO-A表达上调,且5-HT含量升高。SH和CDP治疗在降低肝脏5-HT含量及下调MAO-A表达的同时,可有效地改善肝脏病变:不仅改善肝功能及肝脂肪变性,还明显抑制肝脏ROS(H 2O 2)含量升高,改善氧化应激,并抑制转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的产生,以及炎症和纤维化的发生,且SH和CDP的作用呈协同效应。LX-2细胞研究表明,高糖可上调5-HT 2A R、5-HT合成酶和MAO-A表达,升高细胞内5-HT含量,使细胞的ROS产生增多及肌成纤维细胞化,从而增加TGF-β1合成及炎症和纤维化因子的产生。通过SH拮抗5-HT 2A R,高糖作用被明显抑制;通过CGL抑制线粒体5-HT降解,高糖作用被强烈抑制。SH还可抑制高糖诱导的5-HT合成酶及MAO-A表达上调。结论:高糖诱导HSCs肌成纤维细胞化和TGF-β1产生,从而导致T2DM小鼠肝脏炎症及纤维化损伤,其病理机制可能是诱导了5-HT 2A R表达上调,5-HT合成及降解增加,使线粒体的ROS产生增多,其中,5-HT 2A R的作用是参与了对5-HT合成酶和MAO-A表达的调控。

鹿血晶对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

目的探究鹿血晶对顺铂诱导小鼠急性肾损伤(AKI)的影响。方法雄性ICR小鼠分为对照组、模型组、鹿血晶不同剂量给药组(每次0.20、0.39、0.78 g/kg,每天2次)。预给药7 d后,除对照组外各组腹腔注射顺铂(25 mg/kg)诱导AKI模型,继续给药3 d后处死。采用比色法或ELISA法检测血清及肾组织生化指标,HE、Hoechst 33342染色观察肾组织病理改变及细胞凋亡,Western blot法检测蛋白及其磷酸化表达。结果与模型组比较,鹿血晶可抑制血清肌酐、尿素氮水平升高及白蛋白水平降低,抑制顺铂诱导的肾组织ROS、MDA、TNF-α、IL-1β水平升高,SOD、GSH-Px活性及GSH水平降低,IκBα、NF-κB p65磷酸化表达上调及IκBα表达下调,Bax、caspase3、caspase9表达上调,Bcl-2表达下调,信号分子p38、JNK的磷酸化表达上调,肾小管坏死及细胞凋亡,并且作用呈剂量相关性。结论鹿血晶对肾脏具有保护作用,可剂量依赖性地抑制顺铂诱导的肾组织氧化应激、炎症及细胞凋亡,并改善肾功能,其机制可能与抑制p38、JNK、NF-κB信号通路的激活相关。

沙格雷酯和卡比多巴联合用药对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

目的研究5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)拮抗剂盐酸沙格雷酯(SH)及5-HT合成抑制剂卡比多巴(CDP)对顺铂致小鼠急性肾损伤(AKI)的保护作用。方法72只雄性ICR小鼠随机分入SH 50 mg·kg^(-1),CDP 25 mg·kg^(-1),SH 26.7 mg·kg^(-1)+CDP 13.3 mg·kg^(-1)和SH 50 mg·kg^(-1)+CDP 25 mg·kg^(-1)组,正常对照组和模型组,每组12只。SH和CDP每天2次预防性ig给药,给药7 d后,除正常对照组外,其余小鼠ip给予顺铂25 mg·kg^(-1)诱导AKI。给予顺铂72 h后,采用酶试剂法检测血清肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)和肾组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;ELISA法检测肾组织5-HT、活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)含量;HE染色观察肾组织病理损伤;Hoechst33342荧光染色检测肾组织细胞凋亡;Western印迹法分析肾组织单胺氧化酶A(MAO-A)、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶9和活化胱天蛋白酶3蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组小鼠血清CRE和BUN含量及肾组织5-HT,MDA,ROS,TNF-α和IL-1β水平明显升高(P<0.01),血清Alb含量和肾组织SOD活性明显降低(P<0.01);HE染色和Hoechst33342荧光染色显示,模型组肾组织的主要病变和凋亡区域位于肾小球周围肾小管;Western印迹结果显示,肾组织MAO-A、Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3表达明显上调(P<0.01),Bcl-2表达明显下调(P<0.01)。与模型组相比,模型+SH 50 mg·kg^(-1)、模型+SH 26.7 mg·kg^(-1)+CDP 13.3 mg·kg^(-1)和模型+SH 50 mg·kg^(-1)+CDP 25 mg·kg^(-1)组肾组织TNF-α、IL-1β、Bax、胱天蛋白酶9和活化胱天蛋白酶3均明显降低(P<0.01),Bcl-2升高(P<0.05),各给药组均表现为肾组织病变及细胞凋亡减轻,血清CRE和BUN含量、肾组织5-HT、MDA和ROS含量及MAO-A表达明显降低(P<0.05,P<0.01),SOD活性明显升高(P<0.01);与模型+SH 50 mg·kg^(-1)组和模型+CDP 25 mg·kg^(-1)比较,2个联合用药组肾组织5-HT和TNF-α含量及MAO-A、Bax和活化胱天蛋白酶3表达显著降低(P<0.05,P<0.01),肾组织Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01),提示CDP和SH联合给药具有协同效应;与模型+SH 26.7 mg·kg^(-1)+CDP 13.3 mg·kg^(-1)组相比,模型+SH 50 mg·kg^(-1)+CDP 25 mg·kg^(-1)组血清CRE和BUN含量及肾组织MDA、5-HT,ROS,TNF-α、IL-1β含量和MAO-A表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论SH和CDP可预防顺铂导致的AKI,且两者联合用药作用更为明显,其机制与抑制ROS产生、改善肾组织氧化应激、炎症和细胞凋亡有关。

近端肾小管上皮细胞5羟色胺降解系统激活与肾脏缺血再灌注损伤的关系

目的:探讨肾脏缺血再灌注损伤(RIRI)与5羟色胺(5-HT)降解的关系,评估抑制5-HT合成及5-HT2A受体(5-HT2AR)对RIRI的治疗效果。方法:雄性Wistar大鼠,通过阻断左肾动脉及静脉血流45 min,切除右肾,然后恢复左肾血液供应诱导RIRI。动物随机分为假手术组,RIRI模型组,5-HT2AR拮抗剂盐酸沙格雷酯(SH)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)抑制剂卡比多巴(CDP)预防性给药组,及SH和CDP联合(SH∶CDP=2∶1)预防性给药组(p-SC)及治疗性给药组(t-SC)。各给药组以相同剂量给药,在再灌注24 h后收集血和肾脏。检测血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)浓度及肾组织丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、5-HT和活性氧(ROS)水平。HE染色评估肾损伤。Western印迹和免疫组化检测肾组织色氨酸羟化酶1(Tph1)、AADC、5-HT2AR、单胺氧化酶A(MAO-A)的表达和定位,Western印迹检测Bcl-2相关x蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酶蛋白酶3(Caspase3)和Caspase9蛋白表达。TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡。结果:与假手术组相比,RIRI模型组肾组织中Tph1、AADC、5-HT2AR、单胺氧化酶A(MAO-A)蛋白表达量显著升高(P<0.05),其高表达部位为近端肾小管上皮细胞,与肾组织病变部位重叠。与模型组比较,SH组、p-SC组及t-SC组的肾组织Tph1、AADC、MAO-A表达量升高被明显抑制(P<0.05),但所有给药组均不能抑制5-HT2AR的表达量升高(P>0.05),且CDP组也明显抑制MAO-A的表达量升高(P<0.05);各给药组明显改善肾小管病变、肾功能指标SCr、BUN及氧化应激指标MDA、T-SOD(P<0.05);降低肾组织5-HT及ROS含量(P<0.05);降低TNF-α、IL-6含量;改善凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9表达量(P<0.05)及TUNEL染色显示的细胞凋亡。且p-SC组疗效明显好于SH组及CDP组,显示协同效应,但p-SC组与t-SC组疗效相同。结论:RIRI可能起因于近端肾小管上皮细胞的5-HT合成酶、5-HT2AR及MAO-A表达增加,导致线粒体5-HT降解及ROS产生增多,从而引起氧化应激、炎症及细胞凋亡。通过5-HT2AR拮抗剂及5-HT合成抑制剂联合给药可有效地治疗RIRI。

2型糖尿病引起的疲劳与骨骼肌5-羟色胺降解的相关性研究

疲劳是2型糖尿病(T2DM)常见的并发症。本文研究了T2DM性疲劳与骨骼肌5-羟色胺(5-HT)系统的关系。动物实验用高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠T2DM模型,用5-HT_(2A)受体(5-HT_(2A)R)拮抗剂盐酸沙格雷酯(SH)及5-HT合成抑制剂卡比多巴(CDP)分别或联合给药治疗。细胞实验用D-葡萄糖、棕榈酸或5-HT刺激C2C12细胞。用SH、CDP或单胺氧化酶A(MAO-A)抑制剂氯吉兰分别抑制5-HT_(2A)R、5-HT合成及5-HT降解。本文中动物福利和实验过程均遵循中国药科大学动物伦理委员会的规定。结果表明,小鼠骨骼肌及C2C12细胞均存在5-HT_(2A)R、5-HT合成酶及MAO-A表达。T2DM以及棕榈酸、D-葡萄糖刺激C2C12细胞时,它们的表达明显上调,且棕榈酸是比D-葡萄糖更敏感的刺激它们表达的因子。转棒实验及生化指标检测均表明,T2DM性疲劳起因于骨骼肌5-HT_(2A)R、5-HT合成及5-HT降解的增加。5-HT_(2A)R通过介导MAO-A表达、5-HT合成,间接调控5-HT降解。而MAO-A通过介导5-HT降解,调控细胞炎症、线粒体的ROS产生及膜电位去极化,还抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1(PGC-1)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)及ATP合成酶6(ATP6)表达,从而抑制线粒体功能,如脂肪酸β氧化和ATP合成。用SH和CDP可有效地治疗T2DM性疲劳,同时也可降血糖和血脂,且联合给药有明显的协同效应。

鹿血晶通过降低肾小管上皮细胞的5-羟色胺合成及降解抑制顺铂诱导的肾损伤

目的探讨鹿血晶保护肾脏以及抑制顺铂诱导肾损伤的作用机制。方法人肾小管上皮HK-2细胞设对照组、模型组及鹿血晶(160、400、1000μg/mL)组和单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)抑制剂氯吉兰(15μmol/L)组,加入药物预处理1 h后加入顺铂(20μmol/L)刺激24 h诱导细胞损伤。雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组及鹿血晶(0.78 g/kg)组,鹿血晶组预给药7 d,然后模型组及鹿血晶组ip顺铂(25 mg/kg)诱导肾损伤,继续治疗3 d后处死动物。检测细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平,以及细胞及小鼠肾组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平;采用荧光探针DCFH-DA、Mito-Tracker Red CMXRos及荧光染料Hoechst 33342分别检测细胞内ROS含量、定位及细胞凋亡情况;Western blotting法检测细胞B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-9、NADH脱氢酶1(NADH dehydrogenase 1,ND1)、细胞色素B(cytochrome b,CYTB)、ATP合成酶亚单位6(ATP synthase 6,ATP6)、核因子-κB p65(nuclear factor kappa-B,NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(phosphorylated NF-κB p65,p-NF-κB p65)、抑制子κBα(inhibitor of NF-κB,IκBα)、p-IκBα蛋白表达,细胞及小鼠肾组织色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase,Tph1)、芳香簇氨基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase,AADC)、5-HT2A受体(5-HT2A receptors,5-HT2AR)、MAO-A蛋白表达;采用苏木素-伊红(HE)染色检测小鼠肾组织病理损伤;采用免疫组化法检测小鼠肾组织Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表达。结果与模型组比较,鹿血晶可抑制HK-2细胞内ROS、MDA及上清液中TNF-α、IL-1β水平(P<0.05、0.01),降低细胞内GSH、SOD水平(P<0.05、0.01),抑制细胞凋亡。鹿血晶(1000μg/mL)组与氯吉兰组的作用效果接近,两组对顺铂诱导NF-κB p65磷酸化、细胞凋亡激活(Bax、Caspase-3、Caspase-9表达上调及Bcl-2表达下调)、呼吸链功能下降(ND1、CYTB、ATP6表达下调及ATP水平降低)的逆转作用也接近。并且,鹿血晶(1000μg/mL)组可明显抑制顺铂诱导的HK-2细胞Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表达上调以及5-HT含量升高(P<0.05、0.01),而氯吉兰组使5-HT水平进一步升高(P<0.01)。荧光探针检测表明,线粒体是顺铂刺激时HK-2细胞产生ROS的部位,且鹿血晶(1000μg/mL)组和氯吉兰组对其有相似的抑制效果。HE染色显示,顺铂致小鼠肾组织损伤的部位主要在近端肾小管上皮细胞,免疫组化显示该部位也是Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表达上调最明显的部位。鹿血晶可抑制顺铂诱导的Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A蛋白表达的上调及肾组织5-HT、ROS含量升高(P<0.01)。结论鹿血晶活性成分抑制顺铂诱导肾损伤的机制可能是直接作用于肾脏近端肾小管上皮细胞,抑制顺铂对细胞Tph1、AADC、5-HT2AR、MAO-A表达的上调,从而抑制细胞的5-HT合成及线粒体5-HT降解,达到抑制线粒体ROS生成、保护呼吸链,最终抑制氧化应激、炎症、细胞凋亡的效果。

肾脏5-羟色胺合成和降解在高血糖诱导肾损伤时的作用研究

糖尿病患者常出现高血糖性肾损伤(hyperglycemic kidney injury,HKI)并发症。本文研究了高血糖致肾脏5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)系统表达异常与HKI的关系。动物实验用高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型,用5-HT_(2A)受体(5-HT_(2A)receptor,5-HT_(2A)R)拮抗剂盐酸沙格雷酯(sarpogrelate hydrochloride,SH)及5-HT合成抑制剂卡比多巴(carbidopa,CDP)分别或联合给药治疗。细胞实验用D-葡萄糖(D-glucose,D-Glu)刺激人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells,HMC),并用SH、CDP或单胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)抑制剂氯吉兰分别抑制5-HT_(2A)R、5-HT合成及5-HT降解。实验用PAS染色法(periodic acid-Schiff stain)和Masson染色、免疫组化和Western blot、荧光探针、酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和酶试剂分别检测组织病理学、蛋白表达、细胞内活性氧和生化指标。本文中,动物福利和实验过程均遵循中国药科大学动物伦理委员会的规定。结果表明,小鼠肾脏的肾小球基底膜、肾小管上皮细胞和HMC细胞均存在5-HT_(2A)R、5-HT合成酶及MAO-A表达,且在T2DM小鼠及高浓度D-Glu刺激HMC细胞时被上调;以肾功能异常、肾小球肿胀及基底膜增厚和纤维化为主要表现的HKI与肾脏5-HT_(2A)R表达上调、5-HT合成及5-HT降解的增加密切相关。其中,5-HT_(2A)R可介导细胞的5-HT合成酶及MAO-A的表达;而MAO-A通过催化5-HT降解、使线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增多,导致核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的磷酸化、炎症因子产生及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达上调及胶原产生。用SH和CDP可有效治疗HKI,且联合用药有协同效应。

博来霉素和放射线诱导的间质性肺炎与5-羟色胺降解系统激活的关系及其治疗探讨

本课题组前期研究发现,细胞存在一个5-羟色胺(5-HT)降解系统(5DS),包括5-HT2A受体(5-HT2AR)、5-HT合成酶及单胺氧化酶A(MAO-A)。5-HT2AR可调控5-HT合成酶及MAO-A的表达,5DS的激活表现为这些蛋白的同时上调,导致线粒体活性氧(ROS)产生。本研究评估间质性肺炎(IP)与5DS激活的关系,并观察抑制5DS对IP的治疗作用。建立博来霉素(BLM)致小鼠IP模型和放射线(Rad)致大鼠IP模型。使用5-HT2AR拮抗剂盐酸沙格雷酯(SH)、5-HT合成抑制剂卡比多巴(CDP)或SH、CDP联合(SH∶CDP=2∶1)治疗BLM和Rad致IP模型。本文中动物福利和实验过程均遵循中国药科大学动物伦理委员会的规定。免疫组化及Western blot检测表明,两种IP模型中所有肺组织细胞的5-HT合成酶表达均明显上调,而5-HT2AR、MAO-A表达上调以巨噬细胞最明显。HE染色及Masson染色表明,SH、CDP治疗明显降低了两种IP模型中肺间质增厚、肺泡萎缩塌陷、大量巨噬细胞浸润及间质纤维化;且SH、CDP联合治疗几乎消除了两种IP模型中的肺组织病变。氧化应激、炎症和纤维化相关因子检测表明,SH、CDP联合治疗也几乎消除了ROS、丙二醛的含量升高,超氧化物歧化酶活性的降低,肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β含量的升高,核因子-κB磷酸化表达及α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶2、胶原Ⅰ表达的上调。SH、CDP显示协同效应。结果提示,5DS激活可能与IP的发生密切相关,主要表现为肺组织细胞的5-HT合成增多及巨噬细胞的5-HT合成及降解增多,抑制5DS可有效地治疗IP。