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鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制
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作者 张秋爽 叶彩媚 +5 位作者 牛银杰 林强 梁红茹 罗霞 李宁求 付小哲 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期54-62,共9页
为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在... 为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。 展开更多
关键词 鳜弹状病毒(SCRV) 鳜c-Myc 蛋白互作 谷氨酰胺代谢
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大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用
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作者 王若瑄 罗霞 +5 位作者 李宁求 林强 牛银杰 梁红茹 付小哲 吕爱军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2024年第4期21-27,共7页
【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗... 【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1024000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙虹彩病毒 主衣壳蛋白 多克隆抗体
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Rho A-Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用
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作者 谭有燕 牛银杰 +4 位作者 李宁求 罗霞 林强 梁红茹 付小哲 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2024年第5期12-20,共9页
【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细... 【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂(CCG-1423和Rhosin)、Rock 1抑制剂(Thiazovivin和Y-27632)及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。 展开更多
关键词 脾肾坏死病毒 病毒复制 Rho A-Rock 1信号通路
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浅谈大口黑鲈无病毒亲本选育技术
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作者 余明海 林强 +5 位作者 付小哲 罗霞 梁红茹 牛银杰 李宁求 邓德基 《海洋与渔业》 2023年第2期96-97,共2页
大口黑鲈,近年来正如火如荼地在全国推广养殖,据《2022中国渔业统计年鉴》统计,2021年全国养殖产量已突破70万吨.目前苗种繁育企业、养殖户平均育苗成活率不足10%;其中,亲鱼产卵期间的损耗成为直接导致苗种繁育企业亏损的主要原因.如何... 大口黑鲈,近年来正如火如荼地在全国推广养殖,据《2022中国渔业统计年鉴》统计,2021年全国养殖产量已突破70万吨.目前苗种繁育企业、养殖户平均育苗成活率不足10%;其中,亲鱼产卵期间的损耗成为直接导致苗种繁育企业亏损的主要原因.如何做好后备亲鱼选择以及亲鱼产前营养强化、减少亲鱼损耗、增加产卵数量,公开研究报道较少. 展开更多
关键词 企业亏损 育苗成活率 苗种繁育 后备亲鱼 大口黑鲈 养殖产量 中国渔业统计 亲本选育
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狂犬病毒体内移行研究进展 被引量:2
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作者 梁红茹 谭业平 +2 位作者 江飚 张靖 郭霄峰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1107-1110,共4页
关键词 狂犬病毒 体内移行 中枢神经系统感染 免疫覆盖率 新型疫苗 致病机制 致死性
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鳜蛙病毒及鳜弹状病毒双重PCR检测方法的建立及应用 被引量:3
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作者 梁红茹 黄瑜聪 +6 位作者 付小哲 林强 刘礼辉 牛银杰 黄志斌 林蠡 李宁求 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期290-295,共6页
为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV... 为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV,通过优化退火温度和引物浓度建立了可以同时检测SCRIV(400 bp)和SCRV(280 bp)的双重PCR方法。利用该方法对传染性胰坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、锦鲤疱疹病毒、新加坡石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、罗非鱼湖病毒及鲤春病毒血症病毒等鱼类常见病毒均无扩增条带,而仅对SCRIV和SCRV有特异性扩增条带,特异性较强;该方法对p-SCRIV的检测下限是1 000拷贝/μL,对p-SCRV检测下限是430拷贝/μL,敏感性较高。对21份临床样品的检测结果表明该双重PCR方法的扩增结果与单一PCR扩增结果一致,二者的符合率为100%。本研究建立的双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较高,可以用于上述两种病毒的快速鉴别检测和分子流行病学调查。 展开更多
关键词 鳜蛙病毒 鳜弹状病毒 双重PCR
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鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 梁红茹 范芷仪 +7 位作者 蔡秀珠 付小哲 林强 刘礼辉 黄志斌 牛银杰 林蠡 李宁求 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2020年第3期39-46,53,共9页
【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方... 【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。 展开更多
关键词 鳜弹状病毒 传染性脾肾坏死病毒 双重PCR 病毒检测
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鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
8
作者 梁红茹 蔡秀珠 +7 位作者 范芷仪 林强 付小哲 刘礼辉 黄志斌 牛银杰 林蠡 李宁求 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期929-934,共6页
为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法... 为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL^1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。 展开更多
关键词 鳜鱼弹状病毒 N基因 TaqMan荧光定量PCR
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传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立 被引量:1
9
作者 梁红茹 马赛亚 +6 位作者 付小哲 林强 刘礼辉 牛银杰 黄志斌 林蠡 李宁求 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2021年第11期17-24,共8页
【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV)和鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)的三重PCR检测方法,为鳜鱼... 【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV)和鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 传染性脾肾坏死病毒 鳜鱼蛙病毒 鳜弹状病毒 三重PCR 混合感染
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狂犬病毒新型快速荧光斑点抑制实验方法的建立 被引量:1
10
作者 梁红茹 刘晓慧 +2 位作者 陈晶 孙招金 郭霄峰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期619-622,共4页
目的建立一种新型的快速荧光斑点抑制实验用于狂犬病毒抗体的检测。方法本研究以携带绿色荧光蛋白基因的嵌合狂犬病毒HEP-GFP株为基础毒株,建立了一种新型快速荧光斑点抑制实验(RFFIT-GFP);并对多份人、犬、猫的血清进行了检测,还将该... 目的建立一种新型的快速荧光斑点抑制实验用于狂犬病毒抗体的检测。方法本研究以携带绿色荧光蛋白基因的嵌合狂犬病毒HEP-GFP株为基础毒株,建立了一种新型快速荧光斑点抑制实验(RFFIT-GFP);并对多份人、犬、猫的血清进行了检测,还将该检测结果与传统的RFFIT,ELISA相比较。结果与结论RFFIT-GFP和RFFIT,ELISA测定的结果基本相一致,特异性都比较高,而且RFFIT-GFP是一种比它们更为简便、经济的检测方法。 展开更多
关键词 狂犬病毒 绿色荧光蛋白 快速荧光斑点抑制实验
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我国狂犬病流行的情况及防治对策 被引量:8
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作者 梁红茹 刘晓慧 孙招金 《中国动物保健》 2009年第3期48-50,52,共4页
狂犬病是一种病死率几乎高达100%的人畜共患病,在我国广泛的流行且近年来狂犬病的发病率有所升高。本文从狂犬病的流行情况,流行的原因和防治的对策进行综述,为进一步了解狂犬病和防治狂犬病提供参考。
关键词 狂犬病 防治 人畜共患病 流行情况 病死率 发病率
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弓形虫病的流行情况和预防 被引量:10
12
作者 梁红茹 赖木海 江飙 《中国动物保健》 2009年第11期88-90,共3页
弓形虫病是一种人畜共患病,它对于优生优育的危害最严重。犬为刚地弓形虫中间宿主,猫为终末宿主,随着经济的发展,养宠物的人越来越多,弓形虫病发病率逐年升高,这一疾病也应受到重视。本文从弓形虫病的病原学,流行情况和预防进行综述,为... 弓形虫病是一种人畜共患病,它对于优生优育的危害最严重。犬为刚地弓形虫中间宿主,猫为终末宿主,随着经济的发展,养宠物的人越来越多,弓形虫病发病率逐年升高,这一疾病也应受到重视。本文从弓形虫病的病原学,流行情况和预防进行综述,为进一步了解和防治弓形虫病提供参考。 展开更多
关键词 弓形虫病 流行 防治
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锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定 被引量:13
13
作者 李莹莹 王庆 +6 位作者 曾伟伟 潘厚军 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1159-1166,共8页
2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官... 2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。 展开更多
关键词 锦鲤 锦鲤疱疹病毒 TK基因 病毒鉴定
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表达绿色荧光蛋白嵌合狂犬病病毒HEP-GFP株的拯救 被引量:9
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作者 刘晓慧 艾军 +2 位作者 郭霄峰 孙京臣 梁红茹 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期401-403,共3页
Green fluorescent protein(GFP)gene was inserted into the pseudogene(ψ)region of genome of rabies virus rHep-Flury strain,and a recombinant rabies virus carrying GFP,designated as HEP-GFP,was rescued by reverse geneti... Green fluorescent protein(GFP)gene was inserted into the pseudogene(ψ)region of genome of rabies virus rHep-Flury strain,and a recombinant rabies virus carrying GFP,designated as HEP-GFP,was rescued by reverse genetics system.It was demonstrated that green fluorescent protein could be expressed in the chimeric virus after 5 passages in BHK-21 cell line.The research indicated that the pseudogene(ψ)region in the genome of rHEP-Flury strain,as an independent functional unit in the process of virus assembly,could independently carry and express exogenous genes. 展开更多
关键词 狂犬病毒 嵌合病毒 绿色荧光蛋白
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基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用 被引量:5
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作者 殷亮 王庆 +6 位作者 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期570-576,共7页
为了建立和应用可检测基因I型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因I型GCRV的s6保守序列,分别设计扩增目的条带661bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片... 为了建立和应用可检测基因I型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因I型GCRV的s6保守序列,分别设计扩增目的条带661bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×10^7~3.9×10^1拷贝/uL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/uL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因I型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因I型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 基因I型 TAQMAN Real—Time PCR 定量分析
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析 被引量:3
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作者 李永刚 曾伟伟 +6 位作者 王庆 殷亮 王英英 梁红茹 刘春 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期449-456,共8页
为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表... 为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 HZ08株 S10编码蛋白 多克隆抗体
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舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:4
17
作者 刘礼辉 胡蕾 +6 位作者 杨圆圆 方伟 林强 付小哲 梁红茹 赵永亮 李宁求 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2019年第8期17-24,共8页
【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检... 【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 舒伯特气单胞菌 rpoD基因 实时荧光定量PCR
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约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价 被引量:2
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作者 付小哲 方伟 +5 位作者 林强 刘礼辉 梁红茹 黄志斌 徐德海 李宁求 《南方水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期33-38,共6页
为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和... 为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P<0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P<0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P<0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P<0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P<0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P<0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。 展开更多
关键词 约氏黄杆菌 减毒活疫苗 溶菌酶 免疫球蛋白 相对免疫保护率
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狂犬病毒HEP-Flury株基质蛋白的原核表达及纯化 被引量:2
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作者 江飙 郑佳琳 +3 位作者 邝贞结 梁红茹 徐蕙 郭霄峰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期408-410,共3页
为原核表达狂犬病毒(RV)基质蛋白(M),本研究以RV的HEP-Flury株全长重组质粒为模板扩增M基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-M并转化至宿主菌E.coli M15(pREP4),在IPTG的诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示M蛋白为... 为原核表达狂犬病毒(RV)基质蛋白(M),本研究以RV的HEP-Flury株全长重组质粒为模板扩增M基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-M并转化至宿主菌E.coli M15(pREP4),在IPTG的诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示M蛋白为25ku。Western blot检测证明,重组蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗狂犬病毒多克隆抗体特异识别。本研究为狂犬病诊断方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 基质蛋白 原核表达 纯化
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鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究 被引量:1
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作者 罗霞 付小哲 +4 位作者 林强 刘礼辉 牛银杰 梁红茹 李宁求 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2022年第1期1-9,共9页
【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对... 【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。【结果】各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10^(8.58)~10^(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10^(7.38)~10^(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10^(4) TCID_(50)/mL、SCRV按10^(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1300 bp的MCP基因和1500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。【结论】10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。 展开更多
关键词 鳜鱼病毒病 传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 弹状病毒(SCRV) 毒种库 种子批 二联灭活疫苗
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