重组人生长激素体内生物活性测定中美药典方法对比研究

目的:对重组人生长激素(rhGH)中国药典与美国药典的体内生物活性测定方法进行试验比较与梳理分析。方法:按照《中国药典》2015年版四部通则1219和《美国药典》40版通则126的rhGH去垂体大鼠体内生物测定法,分别测定3批rhGH生物活性。结果与结论:应用二种方法测定3批rhGH原料生物效价的结果相近。通过分析比较两种测定方法的结果及各个环节,可以得出结论,中国药典与美国药典的rhGH体内生物活性测定方法基本相同。

In-cell Western法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞,用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞,采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平,进行人胰岛素的体外生物学活性测定;根据《中华人民共和国药典》2020年版通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法”对该方法进行专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证;以重组人胰岛素国家标准品为参比品,采用本方法测定人胰岛素原料药及其他人胰岛素类似物的生物学活性相对效价。结果:不同浓度的人胰岛素作用于CHO-INSR B1284细胞后具有较好的剂量依赖性;5个效价浓度的待测品经8次测定,相对效价的几何均值分别为:(63.76±4.38)%,(78.01±5.97)%,(99.52±4.62)%,(122.84±7.4)%,(151.71±8.81)%,相对偏倚均在±5%范围内,对应的几何变异系数(GCV,%)均<11%,GCV的置信上限均<20%;采用该方法能有效检测人胰岛素及其胰岛素类似物的效价。结论:利用ICW技术的人胰岛素体外生物学活性测定法专属性强、准确度高、精密度好,可作为人胰岛素生物学活性的常规检测方法。

第1批重组人促卵泡素生物测定用国家标准品的制备与标定

目的:制备并标定第1批重组人促卵泡素(recombinant human follicle-stimulating hormone,Follitropin,rh FSH)国家标准品(生物测定用)。方法:以WHO第2批重组人促卵泡素国际标准品08/282作为标准,采用《中华人民共和国药典》2015年版四部1216卵泡刺激素生物测定法,联合4个实验室参加协作标定。蛋白含量及纯度测定采用SE-HPLC法,解离亚基与聚合体测定采用SDS-PAGE电泳法,RP-HPLC法测定氧化α亚基等主要理化指标,参照国家食品药品监督管理总局颁发的生物制品标准YBS00172015进行;采用N端测序、肽图等方法对标准品制备用原液进行了结构确认,并对待标品进行稳定性考察。结果:重组人促卵泡素待标品经协作标定,最终定值其生物效价为每瓶174 IU;每瓶重组人促卵泡素含量11.5μg,纯度96.46%,测定聚合体、解离亚基、氧化α亚基等相关物质理化指标,均符合规定;稳定性考察合格,N端测序和肽图结果均符合理论要求。结论:本批待标品确认为重组人促卵泡素,可作为第1批重组人促卵泡素(rhFSH)国家标准品,以供重组人促卵泡素及相关制剂的生物效价测定用,本批标准品生物效价为每瓶174 IU。

第1批重组人绒促性素(生物测定用)国家标准品的制备与协作标定

目的:制备并标定第1批重组人绒促性素(recombinant human chorionic gonadotrophin,rHCG)国家标准品(生物测定用)。方法:以WHO第5批绒促性素国际标准品07/364效价为162 IU·瓶^(-1)作为标准,采用2020年版《中华人民共和国药典》四部1209绒促性素生物测定法,联合5个实验室对第1批rHCG待标品进行生物活性协作标定。对待标品原液进行了等电点、肽图、相对分子质量测定等结构确认。对待标品进行了紫外分光光度法蛋白含量测定、SEC-HPLC法纯度和聚体分析、RP-HPLC法氧化亚基分析等关键理化性质分析,并进行了稳定性考察。结果:,rHCG素待标品经协作标定,最终定值其生物效价为6400 IU·瓶^(-1);,rHCG素含量约为290μg·瓶^(-1),SEC-HPLC纯度约为100%。结构确认结果符合要求;聚体、解离亚基、氧化亚基等各项理化指标符合规定;稳定性考察结果满足要求。结论:本批待标品可作为第1批rHCG国家标准品,以供rHCG及相关制剂的生物效价测定用,定值为6400 IU·瓶^(-1)。

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R;大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10^(5)个·mL^(-1),rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^(-1),1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。

时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10^(5)个·mL^(-1)作为靶细胞,以400 pmol·mL^(-1)作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为-12.8%(-16.3%,-9.9%)、2.6%(-4.4%,9.5%)、-5.6%(-11.2%,-0.3%)、-2.9%(-7.7%,-1.8%)、-1.0%(-7.1%,3.9%),相对偏倚及置信区间的绝对值均不超过20%,表明该方法相对准确度良好。5个效价水平的几何变异系数(GCV)及其置信区间的上限均小于20%,结果证明此方法精密性较好。线性范围为64%~156%,斜率为1.031,R;大于0.98。结论:本研究利用时间分辨荧光免疫分析系统成功建立了人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法,该方法可用于人胰岛素体外药效评价和质量控制。

基于Nb2-11细胞增殖的重组人生长激素生物学活性测定方法考察

该研究建立了基于细胞的重组人生长激素(rhGH)生物学活性检测方法,以替代动物体内试验法。首先,用不同浓度的rhGH刺激大鼠淋巴瘤细胞株(Nb2-11细胞)增殖,采用发光活细胞检测系统测定细胞增殖情况,并利用四参数拟合分析计算样品相对效价。随后,对试验条件进行了优化,并对方法的专属性、相对准确度、精密度和线性进行验证,结果显示方法专属性较好,相对准确度的相对偏倚范围为–6.2%~0.9%,线性回归方程相关系数为0.9850,中间精密度几何变异系数范围为5.2%~7.7%,线性范围为50%~200%。最后用该方法和动物体内试验法分别检测15批rhGH原液的生物学活性,结果显示该方法检测结果与动物体内试验法检测结果的一致性良好。该研究建立并验证了测定rhGH生物学活性的Nb2-11细胞增殖法,可作为rhGH生物学活性的常规检测方法用于rhGH的生物学活性评价和质量控制。