重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗的构建及对小鼠的诱导保护作用

目的构建和鉴定重组两歧双歧杆菌介导的铜绿假单胞菌外膜蛋白F-I[rBb(pGEX-OprF-I)]疫苗,研究其对小鼠抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用。方法 PCR扩增OprF和OprI基因,采用基因拼接法剪切,得到OprF-I融合基因,双酶切后定向克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF-I,将该质粒电转化两歧双歧杆菌(Bb),构建rBb(pGEX-OprF-I)疫苗并进行双酶切和PCR鉴定,经异丙基-β-D硫代-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达, SDS-PAGE和Western blot法分析和鉴定表达产物。将21只BALB/c鼠随机分成疫苗组、 Bb-pGEX-1λT空载体和Bb对照组,取5×10~8菌落形成单位(CFU)疫苗口服灌胃,每周连续接种3 d,持续3周。初次免疫后4周用5×10~7 CFU PA01株滴鼻攻击,攻击后2周无菌杀鼠,计数肺组织的细菌菌落数。常规ELISA检测免疫前、初次免疫后4周和攻击后2周的小鼠静脉血中IgG水平。结果 PCR扩增出1289 bp的OprF-I融合基因;双酶切和PCR鉴定证实该基因插入pGEX-1λT并转化Bb,成功构建rBb (pGEX-OprF-I)疫苗;SDS-PAGE显示该疫苗经IPTG诱导可表达相对分子质量(M_r)约68 000的融合蛋白;Western blot表明该蛋白能被铜绿假单胞菌感染的鼠血清特异性识别。疫苗组的肺组织细菌菌落数较对照组明显减少;免疫小鼠血清IgG水平在初次免疫后4周和攻击后2周依次升高,且高于同一时间点的其余对照组。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb(pGEX-OprF-I)疫苗,该疫苗在小鼠抗铜绿假单胞菌感染过程中可产生一定的免疫保护作用。

铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗诱导的保护力及体液免疫应答

目的观察铜绿假单胞菌重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)(pGEX-OprF-I)疫苗免疫及PA01株攻击小鼠后诱导的保护力和体液免疫应答情况。方法将21只小鼠随机分为疫苗组、空载体对照组和Bb对照组,每组7只。将5×10~8CFU疫苗灌胃接种,每日1次,每周连续3 d,共3周。初次接种后4周取5×10~7CFU的PA01株进行滴鼻攻击。攻击后2周杀鼠,取肺组织计数细菌负荷,分别于免疫前、初免后4周和攻击后2周采集小鼠静脉血,常规ELISA法检测血清IgG及其亚类、IgE和IgA抗体水平。结果疫苗组、空载体对照组和Bb对照组的肺细菌菌落数分别为(7.43±0.03)Ig CFU/g、(8.86±0.05)Ig CFU/g和(8.87±0.05)Ig CFU/g,疫苗组的菌落数明显低于其余两个对照组(P<0.01)。与免疫前相比,疫苗组的血清IgG及其亚类水平在初次接种后4周均升高,在攻击后2周达更高水平(P<0.01),且高于相同时间点的空载体和Bb对照组抗体水平(P<0.01)。所有组均未检测出IgE和IgA。结论铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗可诱导小鼠产生较好的保护力及体液免疫应答。

铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状

铜绿假单胞菌是一种革兰阴性非发酵和需氧的机会性致病菌,是医院获得性感染的常见病原体。铜绿假单胞菌治疗面临巨大挑战,研制疫苗是防治铜绿假单胞菌感染的有效替代方法。融合外膜蛋白OprF/I是一种保护性抗疫苗以及重组沙门菌疫苗的研制现状进行综述。

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-PopB的构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-PopB,并研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PA01标准株的DNA为模板,通过PCR扩增PopB基因。经酶切后与载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-PopB,电穿孔将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌BL21(pGEX-PopB)的表达,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果PCR扩增出1200 bp的PopB基因;双酶切和PCR证实PopB基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE发现重组菌表达相对分子质量约66×103的融合蛋白,其蛋白表达量约占菌体总量的20%;Western blot证实铜绿假单胞菌感染的鼠血清能特异性识别该重组蛋白。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-PopB,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达具有抗原特异性的融合蛋白。

侵袭性肺炎克雷伯菌肝脓肿综合征1例并文献复习

分析侵袭性肺炎克雷伯菌肝脓肿综合征(IKLAS)的临床特征,以提高对该疾病的认识。回顾性分析该院收治的1例IKLAS患者的临床资料及诊疗过程,并复习相关文献。该例患者具有肺炎克雷伯菌肝脓肿,以及肺脓肿、左下肢软组织感染等肝外侵袭表现,符合IKLAS临床特征,糖尿病是其感染及转移的危险因素,患者经治疗好转出院。IKLAS好发于糖尿病人群,应积极寻找原发灶并筛查肝外其他转移性感染病灶,早期诊断及治疗至关重要。

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-I并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定。重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物。结果基因拼接法获得1289 bp的OprF-I融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1λT中。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×10~3的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18%。Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白。结论成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-I融合蛋白,该蛋白具有反应原性。

铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗诱导的保护力及细胞免疫应答

目的研究铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗免疫及PA01株攻击小鼠后,其诱导产生的保护力及细胞免疫应答。方法将21只BALB/c小鼠随机分为3组,分别为疫苗组、空载体对照组和Bb对照组,取5×10^8菌落形成单位(CFU)疫苗经口灌胃,每周3次,连续3周。初次免疫后4周用5×10^7 CFU的PA01株进行滴鼻攻击。攻击后2 d杀鼠,取肺,计数肺细菌负荷;取脾,制备脾细胞悬液,MTT法检测脾细胞增殖情况,流式细胞术检测脾CD4^+、CD8^+ T细胞亚群变化和脾细胞凋亡。结果与两个对照组的肺细菌菌落数(7.37±0.89)×10^8 CFU和(7.42±0.80)×10^8 CFU相比,免疫小鼠的菌落数量(0.27±0.02)×10^8 CFU减少;疫苗组的脾细胞增殖活性增强;CD4^+ T细胞比例增加;脾细胞凋亡率降低。结论铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-I)疫苗可诱导小鼠产生一定的保护力和有效的细胞免疫应答。

铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-Ⅰ)疫苗免疫及PA01株攻击小鼠后诱导脾细胞因子基因变化的研究

目的观察铜绿假单胞菌重组Bb(pGEX-OprF-Ⅰ)疫苗免疫及PA01株攻击小鼠后诱导的保护力及脾细胞因子INF-γ、IL-12、IL-4、IL-17和Treg的变化。方法将BALB/c小鼠随机分为疫苗组、空载体对照组和Bb对照组,每组7只。取5×10^8 CFU疫苗每日灌胃1次,每周连续3d,共3周。初次接种后4周用5×10^7 CFU/10μl的PA01株进行滴鼻攻击。攻击后2周杀鼠,取肺计数细菌负荷,取脾制备脾细胞悬液,经PaAg刺激培养,PCR扩增脾细胞的INF-γ、IL-12、IL-4、IL-17和Treg基因。结果疫苗组肺细菌菌落数为(0.27±0.02)×10^8 CFU,空载体组为(7.37±0.89)×10^8 CFU,Bb对照组为(7.42±0.80)×10^8 CFU,差异有统计学意义(P<0.01);疫苗组脾细胞扩增出399bp的INF-γ基因片段、300bp的IL-12基因片段、359bp的IL-4基因片段、380bp的IL-17基因片段和250bp的Foxp3基因片段,两对照组扩增均阴性。结论重组Bb(pGEX-OprF-Ⅰ)疫苗可诱导小鼠脾细胞产生多种类型的细胞因子,参与抗Pa感染的免疫应答。

铜绿假单胞菌重组Ef-PopB疫苗的构建、鉴定及表达

目的构建铜绿假单胞菌重组屎肠球菌(Enterococcus faecium,Ef)-PopB疫苗并观察其表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株基因组DNA为模板,PCR扩增PopB基因,然后定向克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-PopB。将该质粒电穿孔转化Ef,构建rEf-PopB疫苗,抽提质粒,经双酶切和PCR鉴定后,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,采用SDS-PAGE和Western blot分别对表达产物进行分析和鉴定。结果PCR成功扩增出1200 bp的PopB基因;双酶切证实PopB基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rEf-PopB疫苗构建成功。SDS-PAGE检测重组疫苗表达相对分子质量约66×10^3的融合蛋白;Western blot检测Pa感染鼠血清能特异性识别该重组疫苗表达蛋白。结论成功构建了rEf-PopB疫苗,其表达产物具有免疫反应性,为Pa疫苗的研制奠定了基础。