日本血吸虫感染诱导产生的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞免疫抑制功能的观察

目的观察日本血吸虫感染小鼠CD4+CD25+T细胞的免疫抑制功能及特征。方法日本血吸虫尾蚴(10±2条)感染BALB/c小鼠,在感染后6周(急性期,10只)和13周(慢性期,10只)取脾脏,制成脾单个核细胞,用免疫磁珠分选出CD4+CD25+T细胞。体外实验,将急性期和慢性期来源的CD4+CD25+T细胞与CD4+CD25-T细胞共培养,3H-TdR掺入法检测细胞增殖情况,ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子。体内实验,将CD4+CD25+T细胞被动转移到日本血吸虫辐照致弱尾蚴免疫的小鼠体内,2周后剖杀取脾,用流式细胞仪检测脾组织中白细胞介素4+(IL-4+)、IL-10+和干扰素γ+(IFN-γ+)CD4+T细胞比例,ELISA检测血清抗辐照致弱尾蚴抗原IgG1和IgG2a水平。结果体外实验显示,在血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)刺激下,与单纯CD4+CD25-T细胞培养组(脉冲指数即cpm值为7615±1058)相比,CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖具明显的抑制作用(P<0.01),并且感染慢性期来源的CD4+CD25+T细胞抑制作用(cpm值为2336±490)强于急性期来源的CD4+CD25+T细胞(cpm值为4467±144)(P<0.05);并对IL-4、IFN-γ和IL-2等细胞因子分泌也具有抑制作用,其中急性期来源的CD4+CD25+T细胞对各细胞因子的抑制率分别为32.0%(P<0.05)、66.3%(P<0.01)和63.2%(P<0.01);慢性期来源的CD4+CD25+T细胞对各细胞因子的抑制率分别为28.4%(P<0.05)、60.1%(P<0.01)和58.3%(P<0.01)。体内实验显示,在辐照致弱尾蚴诱导的免疫应答中,转移慢性期血吸虫感染小鼠的CD4+CD25+T细胞对IFN-γ和IgG2a抗体的产生明显抑制作用(P<0.05)。结论日本血吸虫感染诱导的CD4+CD25+T细胞具明显免疫抑制作用,并呈现优势抑制Th1应答的特征。

颗粒化日本血吸虫M_r22600抗原对小鼠树突状细胞和CD4^+CD25^+调节性T细胞的作用

目的研究颗粒化日本血吸虫Mr22600抗原对小鼠树突状细胞(DCs)功能的影响及诱导CD4+CD25+调节性T细胞的作用。方法体外实验:分别用Sepharose 4B偶联rSj22.6/26GST抗原与可溶性rSj22.6/26GST抗原负载DCs,流式检测DCs表型变化,混合淋巴细胞增殖实验检测DCs功能。将不同抗原负载的DCs,与CD4+T细胞共培养,流式检测观察对CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量的影响。体内试验:将42只BALB/c小鼠随机分6组(每组6～8只),A组免疫Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原,B组免疫福氏佐剂乳化rSj22.6/26GST抗原,C组免疫rSj22.6/26GST抗原,同时设Sepharose4B对照组(D组),福氏佐剂对照组(E组)和PBS对照组(F组),各组均为皮下多点免疫50μg抗原,隔2周加强免疫,共免疫2次。末次免疫后2周处死,无菌取腹股沟淋巴结,制备细胞悬液,流式检测DCs占淋巴结细胞的比例;同时取脾脏,制备成脾脏单个核细胞,流式检测各免疫组CD4+CD25+Foxp3+T细胞占脾细胞的比例。用免疫磁珠分选各免疫组CD4+CD25+T细胞,与CD4+CD25-T细胞共培养,氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖情况。结果体外实验结果显示,DCs经可溶性抗原刺激后表面分子CD40、CD80、CD86表达率分别为(43.5±6.2)%、(37.7±0.1)%和(71.4±1.4)%,经Sepharose4B偶联抗原刺激后表达率分别为(31.2±5.4)%、(32.0±1.6)%和(63.8±1.0)%,与可溶性抗原相比,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原不能有效刺激DCs成熟。Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原负载DCs可诱导CD4+CD25+调节性T细胞扩增。体内实验结果显示,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原免疫小鼠可诱导CD4+CD25+调节性T细胞数量增加,且与可溶性抗原组(cpm值为3558±147)相比,Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原组(cpm值为1420±335)来源的CD4+CD25+调节性T细胞的抑制能力更强。结论 Sepharose4B偶联rSj22.6/26GST抗原与可溶性抗原相比,更易诱导CD4+CD25+调节性T细胞,诱导的CD4+CD25+调节性T细胞具有更强的抑制功能,且这一作用可能与不同性状抗原干预DCs的功能状态有关。

日本血吸虫22.6 kDa抗原编码基因序列中抑制性片段的确定

目的探讨日本血吸虫22.6kDa(Sj22.6)抗原编码基因序列中是否存在抑制性片段。方法用人工合成的来自Sj22.6抗原编码基因序列中的不同寡脱氧核苷酸和自小鼠脾脏分离的单个核细胞共同孵育,以对小鼠具有刺激作用的免疫刺激序列CpG1826作为刺激物,淋巴细胞增殖试验检测待测定寡脱氧核苷酸对CpG1826诱导的增殖是否具有抑制作用及其作用特征。结果存在于Sj22.6抗原编码基因序列中的寡脱氧核苷酸F311能够抑制刺激性CpG1826诱导的淋巴细胞增殖作用(P<0.05);当寡脱氧核苷酸F311与CpG1826的物质的量之比为1∶10和1∶3时无明显抑制作用(P>0.05),当物质的量之比为1∶1和3∶1时,对CpG诱导的淋巴细胞增殖的抑制率分别为11%和58%;寡脱氧核苷酸F311在先于CpG1826孵育2h加入表现出最强抑制作用。结论Sj22.6抗原编码基因序列中存在具有抑制作用的片段,抑制作用与其浓度和作用时间呈正相关。

补益凉解法对病毒性肝炎小鼠免疫调节影响的实验研究

目的:探索补益凉解法对病毒性肝炎小鼠免疫调节的影响。方法:采用高滴度腺病毒尾静脉注射建立小鼠急性肝炎模型,运用免疫组化、淋巴细胞提取分离术、流式细胞术、定量RT-PCR等实验技术,研究补益凉解法对病毒性肝炎小鼠肝损伤、IL-33、ST2、肝脏病理、Th1及病毒载量的影响。结果:补益凉解法使IL-2和IFN-γ水平上调,血清ALT、IL-33、ST2水平下降。结论:补益凉解法对病毒性肝炎肝损伤的有防护作用,其机制可能是通过免疫调节,增强感染小鼠I型免疫应答,从而下调IL-33/ST2的表达、减轻肝脏损伤。

恙虫病东方体感染对内皮细胞Tie2/Akt/Foxo1通路的影响

目的研究恙虫病东方体感染对Tie2/Akt/Foxo1通路的影响。方法本研究应用新建立的小鼠和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)严重恙虫病东方体感染模型,在感染的不同时间点收集小鼠肺脏组织或细胞,用Western blot法检测Tie2/Akt/Foxo1通路蛋白的表达,用RT-PCR法检测炎症因子mRNA的表达。结果感染后,小鼠肺脏血管生成素2(Ang2)表达升高,而Tie2和磷酸化Tie2(p-Tie2)水平显著下降。感染HUVEC的检测结果支持小鼠实验结果,即Ang2升高,而Tie2和p-Tie2降低;添加重组人源血管生成素1(Ang1)可以部分恢复Tie2的改变。进一步研究发现Tie2信号下游蛋白Akt磷酸化降低、Foxo1去磷酸化增加;Foxo1呈细胞核内积累,HMGB1及IFN-γ等炎症因子表达增加。同时发现恙虫病东方体感染HUVEC后,血管内皮生长因子受体2及钙粘素等细胞通透性相关蛋白表达也同Tie2一样降低。结论恙虫病东方体感染抑制Tie2/Akt/Foxo1信号的活化,而该信号在维持血管正常功能中起重要作用,提示Tie2可能是严重恙虫病治疗的一个潜在靶点。

补益凉解法对慢性乙型肝炎IL-33、ST2影响的临床研究

目的:通过观察慢性乙型肝炎患者白细胞介素(IL)-33/ST2表达水平治疗前后的变化,探讨补益凉解法调节肝损伤的作用及其可能作用机制。方法:收集2015年1月至2016年1月广州中医药大学附属深圳市中医院慢性乙型病毒性肝炎患者60例,随机分为观察组和对照组,对照组患者予双环醇50 mg,口服,3次·d^(-1),还原型谷胱甘肽片400 mg,口服,3次·d^(-1);观察组患者则同时予服补益凉解法中药复方,水煎服,每日1剂,2次·d^(-1)。疗程4周。分别在治疗0周和4周检测:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、IL-33、ST2的变化,评价其疗效。结果:观察组患者ALT、AST水平均较治疗前好转,差异具有统计学意义(P<0.01),且明显优于对照组,组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组患者IL-33、ST2较治疗前明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:补益凉解法复方通过免疫调节,降低了IL-33、ST2的浓度,改善了炎症损伤,有利于肝功能恢复。

弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4^+CD25^+Foxp3^+T细胞和NK细胞的影响

目的探讨弓形虫排泄分泌抗原(ESA)对B16F10黑素瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用。方法将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型。采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组:PBS组、B16F10组、PBS+ESA组、B16F10+ESA组,分别于ESA干预后2、4、6d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化。结果 ESA干预4、6d后,荷瘤鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占脾细胞的比例分别为(1.65±0.18)%和(1.56±0.17)%,与荷瘤对照组[分别为(2.47±0.10)%和(2.82±0.12)%]比较差异均有统计学意义(P均<0.05);ESA干预可使CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降。抑制作用以干预后4、6d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%(P均<0.05);荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[(3.58±0.07)%]在ESA干预后6d显著高于荷瘤对照组的(2.61±0.13)%(P<0.05)。同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比(5∶1、10∶1、20∶1)下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%(P均<0.05);ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[(6208.34±443.64)mm3]明显小于荷瘤对照组[(9027.46±1362.01)mm3](P<0.05)。结论弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用。

日本血吸虫感染小鼠肝脏及脾脏NKT细胞的变化

目的观察日本血吸虫感染后小鼠肝脏及脾脏自然杀伤(NK)T细胞的动态变化特征。方法将24只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组,其中3组每鼠经腹部皮肤感染(14±2)条日本血吸虫尾蚴,分别于感染后3、6、12周剖杀小鼠,分离肝脏及脾脏单个核淋巴细胞,应用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD49b单克隆抗体及藻红蛋白(PE)标记的CD3e单克隆抗体标记细胞,流式细胞仪检测CD3/CD49b双阳性的NKT细胞占单核淋巴细胞的比例。体外刺激实验中将分离的正常小鼠脾脏单个核淋巴细胞,分别用SEA、虫卵蛋白、虫卵脂质作为刺激物,观察其中NKT细胞的比例变化。结果日本血吸虫感染小鼠脾脏中NKT细胞,于感染后12周比例为(4.73±0.41)%,显著高于对照组比例(2.07±0.12)%(P<0.01);肝脏NKT细胞在感染后3周(8.03±0.23)%与对照组(8.60±1.48)%无明显变化,但感染后6周及12周NKT比例明显上升,分别为(15.90±0.76)%和(21.00±0.30)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。体外实验结果显示,刺激物为SEA和虫卵脂质时,NKT细胞的比例分别为(0.77±0.03)%及(0.80±0.06)%,明显高于空白对照组(0.53±0.03)%及虫卵蛋白组(0.50±0.06)%(P<0.05)。结论日本血吸虫感染导致小鼠脾脏及肝脏中NKT细胞比例上调,其上调可能与虫卵可溶性抗原中的脂质组分有关。

弓形虫排泄-分泌抗原含糖组分对小鼠调节性T细胞的影响

目的观察弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)含糖组分对小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的影响。方法采用刀豆蛋白A(ConA)琼脂糖凝胶亲和层析技术提取ESA中的含糖组分,经硫酸-苯酚法测定提取物糖含量,并采用BCA法进行蛋白定量测定。将20只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,分别对各组小鼠腹腔注射ESA、ConA结合ESA、ConA未结合ESA、完全RPMI-1640和甘露糖各100μl。4d后处死,流式细胞仪检测各组脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例。结果采用ConA琼脂糖凝胶亲和层析法成功提取弓形虫ESA中含糖成分。与对照组相比(RPMI-1640组和甘露糖组),ESA、ConA结合ESA、ConA未结合ESA注射组小鼠的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例均明显下降(P均<0.01)。结论弓形虫ESA中含糖组分和蛋白组分均能引起小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占脾细胞的比例下降。