蟹类原肌球蛋白基因的克隆与表达

通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。

鲤鱼小清蛋白的纯化及其过敏原性鉴定

目的:分离纯化鲤鱼小清蛋白(parvalbumin),并对其进行过敏原性鉴定,为建立鱼类过敏原检测技术奠定基础。方法:采用硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化鲤鱼小清蛋白,采用点杂交和特异性IgE检测试剂盒筛选鱼类过敏者血清,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术分析确定纯化目标蛋白的性质。结果:硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化方法可以得到电泳纯单一目标蛋白;小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体免疫印迹实验表明,所得纯化蛋白是小清蛋白。此外,免疫杂交结果显示,鱼类过敏者血清能与纯化的小清蛋白发生特异性结合,从而证实了鲤鱼小清蛋白的过敏原性。

锯缘青蟹主要过敏原的纯化与鉴定

以锯缘青蟹为研究对象,从免疫鉴定、分离纯化、抗体制备和免疫学分析等方面对其主要过敏原进行研究。首先利用过敏者血清的免疫印迹法,确定锯缘青蟹的主要过敏原为分子量约38kD的蛋白。然后通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵沉淀及加热处理对分子量为38kD的主要过敏蛋白进行了高度纯化。该蛋白的pI约为4.5,与虾的原肌球蛋白Pena1性质相近,证实了锯缘青蟹的主要过敏原为原肌球蛋白。通过免疫新西兰大白兔,制备了原肌球蛋白的抗血清,采用Protein A Sepharose亲和层析柱对动物抗体进行了纯化。该抗血清效价高,经4×105倍稀释后仍能与抗原进行反应。该抗体与甲壳类动物及软体动物的原肌球蛋白具有较强的免疫交叉反应,可用于食品过敏原检测。

冷藏条件下鲢鱼肌肉蛋白的变化

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法分析比较了鲢鱼在0和4℃下冷藏14 d过程中肌肉蛋白的变化情况.结果表明:在2种温度下冷藏,肌浆蛋白降解均不显著,其变化趋势基本一致;肌球蛋白重链在0℃下冷藏14 d,4℃下冷藏11 d后发生明显降解;α-辅肌动蛋白和肌动蛋白在2种温度下冷藏均呈逐渐降解的趋势,且在4℃下冷藏降解更为显著;原肌球蛋白在0和4℃下冷藏2 d后均开始降解,此后于0℃冷藏蛋白无明显变化,但于4℃冷藏11 d后降解速度加快.

文蛤特异性过敏原免疫识别的初步研究

目的:贝类是人类最优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一,贝类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展贝类过敏原的识别检测研究很有必要。方法:通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉贝类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE检测试剂盒筛选贝类过敏血清,应用组织捣碎提取蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹等实验方法研究文蛤特异性过敏原。结果:文蛤肌肉主要蛋白的相对分子量约为200kD以上、200、90、80、70、46、36和24kD,其中能被贝类过敏血清特异性识别的90kD组分约占文蛤肌肉总蛋白的10%～20%,且主要为盐溶性蛋白。结论:文蛤的特异性过敏原为90kD蛋白组分。

鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆(英文)

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为21个氨基酸残基。组成丝氨酸蛋白酶活性中心的氨基酸残基(His61,Asp107和Ser197)在MBSP中保守存在。成熟MBSP含有222个氨基酸残基,分子量为24.5 ku,比其天然蛋白的分子量30 ku略小。成熟MBSP的等电点为10.43。鲤MBSP与鲫MBSP,猪胰蛋白酶,牛胰蛋白酶,美洲鲽胰蛋白酶的同源性分别为80.6%,55.8%,55.3%和53.9%。而与仓鼠肌肉中具有胰凝乳蛋白酶性质的蛋白酶的同源性为39.2%。MBSP有高含量的赖氨酸残基(11.93%),此特性可能与该酶的肌原纤维结合特性有关。

原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用

从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体。重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法。利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P>0.05)。结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测。

小学数学教学中渗透学习习惯教育的研究

小学是学生正式接受教育的基础时期,该时期学生学习习惯的培养尤为重要,对今后的学习发挥着关键作用。相较于其他科目而言,数学本身就具有一定的抽象性和难度,其学习目标与要求也相对较高,因而更需要从良好的学习习惯入手,培养学生学习数学的意识、兴趣与方法,从而提高小学数学教学成效。本文分析了小学生数学学习习惯培养的重要性,并提出建议与策略,以供参考。

II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMW S)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及W estern b lot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行W estern b lot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.

虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究

虾类是人类优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。虾类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究非常必要。通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉虾类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE检测试剂盒筛选虾类过敏血清。提取南美白对虾蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹识别虾类过敏蛋白,并对患者识别率最高的虾类的主要过敏原进行分离纯化。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和酶联免疫吸附测定等方法对纯化虾蛋白进行检测分析。患者识别的南美白对虾致敏原的分子质量依次约为200、175、116、85和36kDa,通过硫酸铵盐析及等电点沉淀等方法可以得到电泳纯的虾主要过敏蛋白。免疫印迹结果证实纯化的虾蛋白是具有过敏原性的原肌球蛋白,在此基础上,建立了虾原肌球蛋白的酶联免疫吸附测定方法。

黄鳍鲷骨骼肌α-辅肌动蛋白的分离纯化及抗体制备

目的:黄鳍鲷骨骼肌α-辅肌动蛋白的分离纯化及多克隆抗体制备。方法:采用低温抽提、硫酸铵分级沉淀及两次DEAE-Sepharose离子交换等方法获得α-辅肌动蛋白,并通过免疫大鼠制备了抗α-辅肌动蛋白多克隆抗体。结果:经SDS-PAGE检测得到高纯度的α-辅肌动蛋白,分子质量约为100kDa。Westernblot检测结果显示,制备的多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。结论:从海水黄鳍鲷骨骼肌中得到高度纯化的α-辅肌动蛋白,并制备了滴度高、特异性好的多克隆抗体,为研究鱼类保鲜储藏过程中α-辅肌动蛋白的分解变化提供了重要的手段。