糖尿病小鼠肾小管上皮细胞HNF4A和MUCDHL下调促进肾纤维化

目的:探索肝细胞核因子4α(HNF4A)和μ-原钙黏蛋白(MUCDHL)在糖尿病小鼠肾脏中的作用和联系。方法:(1)选取12周龄的db/m小鼠和db/db小鼠各6只,正常饮食喂养至16周,Western blot检测肾组织纤维连接蛋白(FN)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、上皮钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、HNF4A、Snail和MUCDHL的蛋白水平,免疫组织化学染色观察FN、HNF4A和MUCDHL蛋白的表达及分布情况。(2)体外培养小鼠肾小管上皮细胞(mRTEC),分为正常糖(NG)组、高糖(HG)组、过表达对照组(NG+vector组和HG+vector组)、过表达组(NG+OE-MUCDHL组、HG+OE-MUCDHL组、NG+OE-HNF4A组和HG+OE-HNF4A组)、敲减对照组(NG+control组和HG+control组)和敲减组(NG+si-MUCDHL组、HG+si-MUCDHL组、NG+si-HNF4A组和HG+si-HNF4A组),Western blot检测相关指标的蛋白水平。结果:(1)与db/m组相比,db/db组体重、血糖和尿白蛋白/肌酐比值均显著升高(P<0.05),提示db/db小鼠有明显肾损伤;与db/m组相比,db/db组FN、Col-Ⅲ、α-SMA和Snail蛋白表达升高,E-cadherin、HNF4A和MUCDHL蛋白表达降低(P<0.05);MUCDHL主要表达在肾小管上皮细胞顶端膜,FN主要表达在肾小管间质,HNF4A主要表达在肾小管细胞浆和细胞核。(2)与NG组相比,HG组FN、Col-Ⅲ、α-SMA和Snail蛋白表达升高,E-cadherin、HNF4A和MUCDHL蛋白表达降低(P<0.05);过表达MUCDHL后FN、Col-Ⅲ、α-SMA和Snail蛋白表达降低,E-cadherin和MUCDHL蛋白表达升高(P<0.05),HNF4A表达不变;敲减MUCDHL后相关指标表达与上述效应相反(P<0.05),HNF4A表达不变;过表达HNF4A可使MUCDHL表达增加,其余指标的表达变化与过表达MUCDHL一致;敲减HNF4A表达可使上述效应反转(P<0.05);MUCDHL可能是HNF4A的下游靶基因。结论:HNF4A和MUCDHL在糖尿病小鼠肾小管中表达降低。HNF4A可能通过上调MUCDHL的表达延缓糖尿病肾病肾纤维化进程。

控制血糖对糖尿病大鼠肾组织Ski表达的影响

目的:观察控制血糖前后Ski蛋白在糖尿病(DM)大鼠肾组织的表达变化,探讨其在糖尿病肾病(DN)发病过程中的作用。方法:24只SD大鼠随机分为正常组(NC)、DM组和胰岛素治疗(INS)组,DM组和INS组采用链脲佐菌素复制DM大鼠模型,INS组于造模成功4周后给予胰岛素22 U/(kg·d)治疗6周,于造模后第10周,采用生化法测定糖化血红蛋白(HbA1c)、血糖及24 h尿蛋白量,观察肾组织病理变化,免疫组织化学染色检测肾组织Ski、Collagen-Ⅲ及E-cadherin表达,Western Blot检测SD大鼠肾组织中Ski、转化生长因子β1(TGF-β1)、Collagen-Ⅲ、Smad3及p-Smad3(Ser432/425)蛋白的表达水平。结果:与NC组大鼠相比,DM组大鼠体质量减轻、血糖及Hb A1c增高,肾小管和肾小球纤维化改变明显,INS组上述改变有所改善;免疫组织化学染色显示,肾组织Ski、Collagen-Ⅲ表达从高到低依次为DM组>INS组>NC组(P<0.05),E-cadherin表达从高到低依次为NC组>INS组>DM组(P<0.05); Western Blot检测结果显示,肾组织TGF-β1、Collagen-Ⅲ、p-Smad3(Ser 432/425)和Ski蛋白的表达从高到低依次为DM组>INS组>NC组(P<0.05)。结论:DM大鼠肾组织Ski蛋白表达增高、TGF-β1/Smad3通路活化导致肾脏纤维化;而控制血糖后,Ski蛋白表达下调,TGF-β1/Smad3信号活化减弱,纤维化病变减轻。

miR-21通过下调PPAR-α参与脂质代谢紊乱并促进糖尿病大鼠肾组织及肾小管上皮细胞纤维化病变

目的:探讨微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)下调过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptor-α,PPAR-α)参与脂质代谢紊乱从而促进糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠肾组织及大鼠肾小管上皮细胞纤维化病变的机制。方法:12只SD大鼠随机均分为正常对照(normal control,NC)组和DM组。DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素复制1型糖尿病模型。于模型复制成功后第10周处死大鼠,收集各组大鼠血清和处死前24 h的尿液检测生化指标,HE及天狼星红染色观察肾脏组织病理改变和纤维化病变;real-time PCR检测miR-21及PPAR-αmRNA在肾组织中的表达;ELISA检测白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的表达水平。以高糖培养的肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,敲减miR-21的表达或给予PPAR-α特异性激动剂非诺贝特干预,采用流式细胞术检测非诺贝特干预后细胞凋亡情况。Western blot检测各组肾脏组织及NRK52E细胞中PPAR-α、IL-6、Bax、纤连蛋白(fibronectin,FN)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和α-平滑肌肌动(α-smooth muscle motility,α-SMA)蛋白的表达。双萤光素酶报告基因实验验证miR-21对PPAR-α的转录调控作用。结果:与NC组比较,DM组大鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇和24 h尿蛋白均升高(P<0.05);HE和天狼星红染色结果显示DM组肾小管间质纤维化增加,胶原阳性染色增多,胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)升高(P<0.05);DM组肾组织miR-21表达显著升高,PPAR-αmRNA和蛋白的表达显著减少(P<0.05),IL-18水平及Bax、IL-6、TGF-β1、α-SMA和FN蛋白的表达增多(P<0.05)。双萤光素酶报告基因实验表明,miR-21模拟物可以显著抑制PPAR-α的转录活性,同时下调其蛋白表达水平(P<0.05);miR-21抑制物可逆转高糖对PPAR-α蛋白的抑制作用,并降低FN、IL-6和Bax蛋白的表达(P<0.05);与溶剂对照组相比,非诺贝特可降低高糖诱导的细胞凋亡(P<0.05)。结论:在糖尿病大鼠肾组织中,miR-21表达增加,进而抑制下游靶基因PPAR-α的表达从而促进脂质代谢紊乱,加剧细胞炎症与凋亡反应,参与糖尿病大鼠肾损伤及肾小管上皮细胞纤维化病变。

尾静脉注射BMP-7过表达质粒在小鼠脏器中的表达

目的:研究尾静脉注射骨形成蛋白7(BMP-7)过表达质粒在小鼠心、肝、肺和肾脏组织中的表达及其安全性。方法:将30只小鼠随机分为正常组(NC组)、空载质粒组(NC+Vector组)以及BMP-7过表达质粒组(NC+BMP-7组),NC+BMP-7组和NC+Vector组分别通过尾静脉注射BMP-7过表达质粒或空载质粒,每周1次共注射6周,6周后处死小鼠取动脉血,检测血清中小鼠胆固醇、甘油三酯和血糖含量,收集小鼠心、肝、肺和肾脏组织,采用HE染色观察小鼠肝脏和肾脏组织形态变化,试剂盒比色法检测肝组织中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力,Western Blot检测各组织中BMP-7表达。结果:与NC组比较,NC+Vector组和NC+BMP-7组小鼠胆固醇、甘油三酯和血糖无明显变化,肝、肾组织显微镜观察无明显形态学改变,肝组织中AST和ALT的活力无明显增高,但小鼠心、肝、肺和肾脏组织中BMP-7蛋白明显增加,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论:通过尾静脉注射BMP-7过表达质粒可以在小鼠心、肝、肺和肾脏中高表达,且不具有明显的肝、肾毒性。

控制血糖通过下调KLF6而抑制STZ所致的1型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞损伤

目的:用胰岛素(INS)控制1型糖尿病(DM)大鼠血糖,观察糖尿病肾病(DKD)发病过程中大鼠肾小管上皮细胞核转录因子Krüppel样因子6(KLF6)的表达和作用。方法:(1)将SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、DM组和INS治疗组(INS组)。采用链脲佐菌素(STZ)复制1型DM大鼠模型,INS组于造模成功4周后给予INS(22 U·kg^(−1)·d^(−1))治疗6周。于造模后第10周处死所有大鼠,检测相应生化指标;HE和天狼星红染色观察肾组织病理学变化;免疫组织化学染色法检测肾组织KLF6的表达;Western blot检测大鼠肾组织中KLF6、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)和Bax蛋白的表达水平;RT-qPCR检测PPARγ的mRNA表达变化。(2)将大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞予以正常糖(NG)或高糖(HG)培养以及在HG环境中培养24 h后置于NG中培养24 h(HGtoNG),或转染KLF6 siRNA(si-KLF6)后HG培养及转染KLF6过表达质粒(OE-KLF6)后NG培养,分为NG组、HG组、HGtoNG组、NG+vector组、NG+OE-KLF6组和HG+si-KLF6组,共6组。Western blot检测KLF6、PPARγ、钙黏蛋白(E-cadherin)、纤维连接蛋白(FN)、IL-6和Bax表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:(1)与NC组相比,DM组大鼠肾重/体重、血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、血尿素氮和24 h尿蛋白明显升高,肾小管灶性萎缩,系膜及间质轻度节段增生,并伴有胶原的明显沉积,肾组织KLF6、IL-6、TNF-α、α-SMA、ColⅢ和Bax蛋白表达增多,KLF6阳性染色主要定位在肾小管胞质及胞核,而PPARγ的mRNA和蛋白表达水平均降低。与DM组相比,INS治疗后,上述生化指标均降低,肾组织病理形态学显示肾纤维化病变减轻,KLF6、IL-6、TNF-α、α-SMA、ColⅢ和Bax蛋白表达均有所降低,而PPARγ的mRNA和蛋白表达水平均升高。(2)过表达KLF6可使NRK-52E细胞中PPARγ和E-cadherin的表达降低,FN和IL-6表达增加,细胞凋亡率增加;敲减KLF6表达可使得上述效应反转。与NG组相比,HG组KLF6、FN和IL-6表达增加,PPARγ和E-cadherin表达减少;与HG组相比,HGtoNG组上述效应反转。结论:HG可使KLF6蛋白表达增多,抑制PPARγ的mRNA和蛋白表达;KLF6可能通过抑制PPARγ而影响炎症因子的表达和凋亡反应,加剧了纤维化进程,从而参与DKD的发生发展;而控制血糖可通过下调KLF6而抑制1型DM大鼠肾小管上皮细胞损伤。

Smad3促进肾小管上皮细胞转分化在高糖诱导肾脏纤维化中的作用

目的:观察高糖条件下Smad3对肾小管上皮细胞转分化的影响,探讨Smad3在高糖诱导肾脏纤维化中的作用。方法:将体外培养的肾小管上皮细胞分为正常糖组(NG组)、高糖组(HG组),Western blot鉴定细胞表型(E-cadherin及Desmin蛋白)及对高糖刺激后表型蛋白的变化;Western blot和Real-time PCR验证敲低Smad3质粒(Smad3-sh)、过表达Smad3质粒(OE-Smad3)转染肾小管上皮细胞细胞后Smad3蛋白及mRNA表达水平;分别在NG和HG条件下敲低或过表达肾小管上皮细胞Smad3蛋白,采用Western blot检测Smad3、p-Smad3、E-cadherin及Desmin蛋白表达水平。结果:NG组E-cadherin蛋白高表达,而Desmin表达较少;与NG组比较,HG刺激后E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05),Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05);敲低肾小管上皮细胞中Smad3后,E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05),Desmin蛋白表达显著减少(P<0.05);过表达肾小管上皮细胞中Smad3后,E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05),Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论:Smad3能促进HG诱导肾小管上皮细胞转分化过程,从而促进高糖介导的纤维化发生。

HGF上调SnoN mRNA抑制高糖介导大鼠肾小管上皮细胞纤维病变机制

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)是否通过转录共抑制因子(SnoN)影响高糖介导大鼠肾小管上皮细胞纤维病变。方法:将体外培养NRK-52E细胞分为对照组(NG组,正常糖培养液培养)、高糖对照组(HG组,高糖培养液培养)、10μg/LrhHGF干预组(低剂量rhHGF组,10μg/LrhHGF高糖培养液培养)及20μg/LrhHGF干预组(高剂量rhHGF组,20μg/LrhHGF高糖培养液培养);培养48h时,采用Westernblot方法检测各组细胞SnoN、细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)信号通路及E-钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及胶原蛋白Ⅲ(Col-Ⅲ)蛋白的表达,qRT-PCR技术检测SnoNmRNA的表达。结果:与NG组相较,HG组细胞中α-SMA、Col-Ⅲ蛋白和活化的ERK1/2表达上调(P<0.05),E-cadherin、SnoN蛋白表达下调(P<0.05),SnoNmRNA表达增高(P<0.05);然而与HG组比较,在rhHGF干预组,10μg/L或20μg/LrhHGF均可使NRK-52E细胞α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表达减少(P<0.05),而E-cadherin、SnoN蛋白和活化的ERK1/2表达增多(P<0.05),SnoNmRNA表达进一步增高(P<0.05)。结论:HGF阻断或对抗高糖介导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化和间质细胞外基质的沉积,其机制可能是通过活化ERK1/2通路上调SnoNmRNA表达实现。

硫辛酰胺对db/db小鼠肝损伤的保护作用研究

目的观察硫辛酰胺(ALM)对db/db小鼠肝损伤的保护作用及可能机制。方法db/db小鼠随机分为糖尿病组(DM)和ALM组,C57BL/6J小鼠为正常对照组(NC),每组各6只。ALM组于第9周时予ALM[100 mg/(kg·d)]进行灌胃干预,干预8周后处死小鼠,检测生化指标及肝组织谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醇(MDA)表达量,油红O、HE染色观察肝脏病理学改变,Western blot法检测肝组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)蛋白水平。结果与NC组比较,DM组体重、TG、TC、FBG升高,MDA含量升高[(0.73±0.04)vs(0.92±0.17)nmol/mg,P<0.05],CAT活性降低[(1.08±0.18)vs(0.52±0.14)U/mg,P<0.05],ALT、AST活性升高[(16.85±3.84)vs(22.42±4.56)U/g,(6.07±1.91)vs(8.19±1.51)U/g,P<0.05],Nrf2、HO-1的表达升高[(0.33±0.25)vs(1.81±0.34),(0.29±0.13)vs(1.25±0.19),P<0.05]。与DM组比较,ALM组体重、TG、TC降低,MDA降低[(0.92±0.17)vs(0.56±0.11)nmol/mg,P<0.05],CAT活性升高[(0.52±0.14)vs(0.91±0.20)U/mg,P<0.05],ALT、AST活性降低[(22.42±4.56)vs(17.08±5.08)U/g,(8.19±1.51)vs(5.10±0.46)U/g,P<0.05],Nrf2、HO-1表达降低[(1.81±0.34)vs(1.01±0.30),(1.25±0.19)vs(0.52±0.17),P<0.05]。结论ALM可抑制T2DM小鼠肝损伤的发生发展,其机制可能是通过改善肝组织脂质沉积、抑制氧化应激,调节Nrf2、HO-1蛋白表达以实现。