阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78·0%(39/50)。结论构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。

温州地区鼠体广州管圆线虫的感染情况

目的 :了解温州地区广州管圆线虫终宿主感染情况 ,为本地区广州管圆线虫防治工作提供参考依据。方法 :剖检温州各地捕获之鼠 2 0 6 9只。结果 :鼠平均感染率为 15 .3% ,褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠感染率分别为 2 0 .4%、6 .0 %、4.6 %。结论 :温州地区鼠类广泛感染广州管圆线虫 ,其中褐家鼠是最主要的终末宿主 。

广州管圆线虫成虫可溶性抗原诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 探讨广州管圆线虫成虫可溶性抗原诱导小鼠的保护性免疫 ,为广州管圆线虫病的免疫预防研究提供科学依据。方法 以广州管圆线虫成虫可溶性抗原隔周腹腔注射免疫小鼠 1次 ,共 3次 ,末次免疫 1w后 ,用 30 0条广州管圆线虫第三期幼虫感染每鼠 ,攻击感染 4w后解剖每鼠检获虫体 ,计算减虫率 ,并观察、测量检获虫体形态、大小。此外 ,还检测了小鼠体内血清特异性抗体IgG和血液嗜酸性粒细胞含量。 结果 免疫组小鼠与对照组比较 ,有极显著的减虫效果 (P <0 .0 1) ,80 0 μg、40 0 μg和 2 0 0 μg免疫原组小鼠的减虫率分别是 44 .0 %、42 .6 %和 18.7%。免疫组小鼠体内检获的虫体比对照组要少。免疫组小鼠血清抗体水平及血液嗜酸性粒细胞绝对值均高于对照组 (P <0 .0 1)。

温州地区人群猪带绦虫/囊虫病流行病学调查

目的:了解温州地区猪带绦虫/囊虫病流行情况,为本地区猪带绦虫/囊虫病的防治工作提供参考依据。方法:运用流行病学方法、血清学和粪便检查对本地区猪带绦虫/囊虫病进行调查。结果:温州地区人群血清囊虫抗体阳性率为0.61％,猪带绦虫病现患率为0.02％,囊虫病现惠率为0.09％。结论:温州地区囊虫病呈零星散发状态,且较多为输入性感染,但仍须重视猪带绦虫病和囊虫病的防治工作。

双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原的研究

目的建立双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原(Cag).方法采用两株抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单克隆抗体,应用双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫CAg,并摸索该法的最佳实验条件.对感染大鼠、小鼠、疑似和确诊广州管圆线虫病病例血清进行检测,评价方法的敏感性;对日本血吸虫、肺吸虫、旋毛虫、囊虫病人血清进行交叉反应试验,评价方法的特异性.结果 10μg/ml单抗包被,酶标记单抗1∶1 600稀释为最佳工作浓度.利用该法检测不同血清广州管圆线虫循环抗原的敏感性为84.2%～87.2%,特异性为100%.结论建立的双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原具有敏感性高、特异性强和经济、简便易行等优点.

幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定

目的 :克隆幽门螺杆菌 (Hp)鞭毛素 B基因 (fla B) ,构建其原核表达系统 ,鉴定融合蛋白免疫性。方法 :采用高保真 PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株 Y0 6中扩增 fla B基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 p ET32 a的fla B表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达 ,采用 Hp全菌抗体的 Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。 ELISA检测 12 5例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中 Fla B抗体和 4 1株 Hp临床菌株 Fla B表达。结果 :所克隆的 fla B基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 .0 0 %。p ET32 a- fla B- BL2 1DE3系统的 Fla B融合蛋白表达量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Fla B融合蛋白能与 Hp全菌抗体发生结合反应 ,免疫家兔能获得高效价抗体。结论 :本研究成功地构建了 Hp fla B高效原核表达系统 ,所表达的 Fla B融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性 ;Hp临床菌株 Fla B表达率高 ,且能刺激机体产生抗体。Fla B可作为 Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原。

ELISA法检测人体广州管圆线虫血清抗体的研究

１９９７年１０－１１月，温州市暴发流行以剧烈头痛、恶心、呕吐、低热等为主要症状的嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎（简称“酸脑”）［１］。流行病学调查表明，其中有１８例患者在发病前１０－１５天在温州某饭店聚餐，并生吃含有广州管圆线虫幼虫的福寿螺，另有７例也主诉...

温州地区中枢神经系统疾病患者脑囊虫感染情况的调查

目的了解温州地区中枢神经系统疾病患者的脑囊虫感染情况。方法用ELISA法检测温州市部分中枢神经系统疾病患者的囊虫特异性循环抗原和抗体。结果 407例中枢神经系统疾病患者血清囊虫特异性循环抗原阳性率为6.39％,特异性抗体阳性率为5.90％,总阳性率为7.13％。结论脑囊虫感染是温州市人群中枢神经系统疾病的一个重要原因,囊虫特异性循环抗原检测可作为中枢神经系统疾病初诊和疗效考核的诊断依据。

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。

ELISA法检测广州管圆线虫感染实验大鼠血清抗体

目的 探讨ＥＬＩＳＡ法检测广州管圆线虫血清抗体的可行性，从而为广州管圆线虫病的免疫诊断提供实验依据。方法 用雌性成虫粗抗原作ＥＬＩＳＡ检测不同时期实验大鼠血清抗体，并选用四种对照血清，以比较该法的特异性。结果 大鼠血清抗体在感染后２０ｄ 适宜检测，４０ｄ 左右达最高峰，８０ｄ 仍维持阳性检测水平。ＥＬＩＳＡ 法对旋毛虫抗体阳性血清、犬弓蛔虫抗体阳性血清、肺吸虫抗体阳性血清和日本血吸虫抗体阳性血清的假阳性率分别是２０－０％ 、１０－０ ％ 、０％ 和０％ 。结论 ＥＬＩＳＡ法用于检测广州管圆线虫血清具有较高的敏感性和特异性。大鼠血清抗体的最佳检测时间是在感染后３０ ～５０ｄ。

温州海产贝类单核细胞增生李斯特菌的污染检查

目的了解温州市海洋贝类单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)的污染状况。方法 2009年7月在温州沿海地区抽取贝类样品进行微生物检测。结果在100份样品中,Lm阳性3份,占总数的3.00%。结论温州市海洋贝类已受到Lm的污染,应加强卫生监督。

广州管圆线虫感染小鼠后在其体内分布及小鼠组织病理学实验观察

为观察广州管圆线虫感染小鼠后在小鼠体内的分布及对小鼠的致病作用 ,以广州管圆线虫第三期幼虫人工感染实验小鼠 ,分批处死后 ,镜检并记录各部位虫体 ,同时进行组织病理学观察。结果感染不同时间后 ,小鼠肝、心、肺、脑、脊髓、肾、眼球、肌肉等部位均发现有幼虫寄生 ,其中脑、脊髓是广州管圆线虫的主要寄生部位。虫体寄生部位因虫体的机械作用和炎症反应而受损。

阴道毛滴虫黏附蛋白ap33基因克隆及其表达

通过提取阴道毛滴虫mRNA ,逆转录合成cDNA ,PCR得到预期长度片段后 ,将其克隆到pUCm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析 ,并与GeneBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将其克隆至表达载体PET-32a。重组子用酶切、PCR和测序鉴定后 ,转化大肠杆菌并以异丙基 -B- D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。从阴道毛滴虫临床分离株中扩增出 92 7bp的ap33的基因片段 ,构建重组质粒PET- 32a (+) - ap33;IPTG诱导后 ,SDS -PAGE显示表达产物的大小约 5 0kDa。

温州市海洋贝类微生物污染状况的调查

目的调查温州市海洋贝类微生物污染状况。方法 2009年7月在温州沿岸地区抽取100份贝类样品进行微生物检测。结果在100份样品中,有67份不同程度地受到微生物污染,占总数的70%,合格率仅为30%。其中污染最为严重的是大肠菌群,占超标总数的61.4%,其次为沙门氏菌占18.6%,副溶血性弧菌占15.7%,李斯特菌占4.3%;也有少部分贝类产品是因细菌总数超标,占总数的6%。结论微生物性污染对温州海洋贝类在一定程度上构成了威胁。

广州管圆线虫的抗原定位研究

目的 为广州管圆线虫抗原的分离、纯化及广州管圆线虫病的免疫诊断等提供实验依据。 方法 运用间接荧光抗体试验 (IFAT)和免疫金银染色试验 (IGSS)对广州管圆线虫的抗原定位进行研究。 结果 在 IFAT中 ,广州管圆线虫的肠管壁、子宫内虫卵的卵细胞、卵巢和皮层具有特异性荧光 ,提示这些器官具有抗原性。而在 IGSS中 ,广州管圆线虫的抗原定位器官只有肠管壁、子宫内虫卵的卵细胞和卵巢 ,而不包括皮层。 结论 虫体的肠管壁是主要的抗原定位器官 ,虫体子宫内虫卵和卵巢亦显示有抗原性 ,这些器官中的抗原与感染宿主的免疫密切相关。

阴道毛滴虫AP33基因克隆与序列分析

目的 :阴道毛滴虫黏附蛋白AP33基因的克隆与序列分析。方法 :提取阴道毛滴虫mRNA ,逆转录合成cDNA ,PCR得到阳性条带 ,将其克隆到pUCm T载体进行PCR、酶切及测序分析 ,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析。结果 :阳性克隆经酶切鉴定 ,目的基因片段长度为 92 7bp。测序结果目的基因与阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 1、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33 2分别具 99%、97%和 94 %的同源性。结论 :成功克隆出阴道毛滴虫AP33基因序列 ,与已公布的AP33序列有很高的同源性。这为今后该蛋白的原核表达和大量制备提供一定的基础。

温州地区广州管圆线虫病的研究

目的 :阐明温州地区 1997年 10～ 11月暴发流行“酸脑”的病因 ,并为该病的防治提供科学依据。方法 :分析患者发病过程及临床症状 ,针对性开展温州地区广州管圆线虫病流行学调查 ,同时用免疫学试验作临床辅助诊断。结果 :温州存在广州管圆线虫的自然疫源地 ,主要中间宿主 (福寿螺 )及终末宿主的感染率分别为 6 9.4 %和 19.5 % ;患者皮内试验及间接荧光抗体试验阳性率分别为 10 0 %和 90 .6 % ,ELISA法用于检测广州管圆线虫血清具有较高的敏感性和特异性。结论 :确定温州地区此次爆发流行的“酸脑”为广州管圆线虫病 ,温州地区为广州管圆线虫病流行区。

青蒿琥酯治疗家犬卫氏并殖吸虫感染的效果观察

目的探讨青蒿琥酯(Art)对双倍体卫氏并殖吸虫病的治疗作用。方法1)卫氏并殖吸虫成虫用含不同浓度Art的RPMI 1640培养基体外培养后作电镜观察;2)实验犬常规感染卫氏并殖吸虫囊蚴,76 d后用青蒿琥酯50和80mg/kg灌胃治疗,103 d解剖犬,作常规病理检查,取出的虫体作电镜观察。结果1)5 mg/kg组体外培养24 h后,虫体萎缩,扫描电镜观察部分体棘消失、倒伏、絮状物附着;透射电镜显示皮层水肿、细胞器及分泌颗粒减少,卵黄腺萎缩,卵巢卵细胞胞浆空泡变等;2)两治疗犬体内虫体萎缩,厚壁囊肿数分别为28和35个,对照犬为16个,差异有显著性(P<0.05);透射电镜显示成虫变化与体外培养试验相似。结论青蒿琥酯对卫氏并殖吸虫有损伤作用。

阴道毛滴虫ap33基因克隆及其表达载体的构建

目的 研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体。方法 提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pLICm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与CenBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接。结果 阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp,,ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99％、97％、94％的同源性。结论 成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性。构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白。