猪非典型瘟病毒云南株Mut蛋白的特征分析及其对宿主细胞NF-κB转录活化的影响

猪非典型瘟病毒(APPV)是近年来新发现的猪病毒性病原,给养猪业健康发展带来了严重的威胁。课题组前期研究发现了APPV云南株(APPV-YN)导致感染猪临床症状非典型化的关键基因Mut,为探讨APPV-YN Mut的生物学特征及其对宿主细胞NF-κB信号通路转录活化的影响,揭示APPV非典型化的机制。利用SnapGene、ProtParam、PredictProtein、TMHMM、SignaIP 4、ProtScale等在线软件对APPV-YN Mut基因表达蛋白的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点等进行分析预测;将重组载体pCMV-Mut转染至HEK-293细胞,确定蛋白稳定表达后利用TNF-α刺激NF-κB信号通路使其活化,分析APPV-YN Mut对NF-κB转录活性及其对NF-κB P65核质转运的影响。生物信息学分析结果显示,Mut蛋白为亲水性的稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,可能主要定位于细胞质,二级结构主要以无规则卷曲为主,三级结构稳定,可能作用于PKC、P38MAPK、PKA、EGFR、CDK5等相关激酶及蛋白受体;Mut蛋白在HEK-293细胞成功表达,大小约为15 ku;Mut对TNF-α激活的NF-кB转录活化有明显抑制作用,干扰NF-κB P65的入核,抑制核质穿梭过程。研究结果为后续进一步在分子水平上探究Mut在APPV非典型化中的作用奠定了基础。

猪静脉血管内皮细胞cDNA文库构建及与猪非典型瘟病毒云南株关键变异基因互作蛋白的筛选

近几年,猪非典型瘟病毒(APPV)在世界多个养猪国家相继报道,临床症状呈不典型性,给养猪业造成了较大的经济损失。为了解猪非典型瘟病毒云南株关键变异基因(APPV-YN Mut)与宿主可能存在相互作用的蛋白,深入研究APPV-YN Mut基因的功能及其非典型化机制,利用酵母双杂交技术,构建了猪静脉血管内皮细胞(SVEC)cDNA文库,并进一步采用建立的SVEC cDNA文库与诱饵质粒pGBKT7-Mut共转Y2H Gold酵母菌,筛选与Mut蛋白相互作用的蛋白,对筛选出的蛋白进行测序和生物信息学分析。结果表明,构建的诱饵载体在酵母细胞中成功表达,且无毒无自激活;构建的SVEC cDNA文库容量大于1×106 CFU/mL,文库滴度6.2×106 CFU/mL,PCR显示文库插入片段大小在250~3000 bp,条带大小不一,符合文库大小要求;与SVEC cDNA文库筛选发现14种与Mut蛋白存在潜在互作的宿主蛋白,通过蛋白功能分析发现这些蛋白主要与病毒复制、细胞凋亡、钙离子结合、蛋白代谢和降解有关。研究结果有助于进一步探索14种潜在互作蛋白中到底哪些与Mut发生密切互作,且与病毒感染宿主密切相关,为研究APPV-YN Mut基因功能及其致非典型化作用机制奠定了理论基础。

西双版纳生态文明制度建设中的非正式制度研究

云南省西双版纳傣族自治州作为全国第一批、云南省唯一的"国家生态文明建设示范州市",保存有中国最完整的热带生态系统。根据其生物多样性的自然资源禀赋、特殊的边疆区位与独特的民族文化,分析西双版纳生态文明非正式制度的表现形式,探析该地区生态文明非正式制度的作用,对完善生态文明制度体系,促进生态文明制度建设具有十分重要的意义。