多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。

VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备

以大肠杆菌O157DNA为模板扩增VT2-B亚单位,纯化后经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX4T-2,构建重组表达质粒pGEX4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了VT2-B-GST融合蛋白的可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的35%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,得到2株融合细胞,制备了腹水单抗,测得单抗的ELISA效价为104。Western blot表明,该单抗能与重组蛋白特异性的结合。特异性单抗的获得为VT2毒素检测方法的建立奠定了基础。

广州地区猴腺病毒7型血清流行病学初步调查

目的评估广州地区猴腺病毒7型(SAdV-7)先存中和抗体阳性率情况。方法首先构建以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的猴重组腺病毒7型载体SAdV7-CMV-LacZ。然后使用化学发光法,检测209份免疫功能正常的成人的血清样本中SAdV-7中和抗体阳性率情况。结果我们发现SAdV-7中和抗体的阳性率为27.8%(58/209)。SAdV-7中和抗体在低滴度时阳性率最高,并且随着滴度的升高,阳性血清分布率逐渐降低。在20～40岁人群中,SAdV-7中和抗体阳性率最高,在<20岁人群中未检测到SAdV-7中和抗体。结论广州地区人群中针对SAdV-7的先存中和抗体阳性率低。因此,SAdV-7在基因治疗及基因疫苗的应用上是一个具有吸引力的候选载体。

HBV特异性CTLs表面CD244和PD-1共表达与慢性乙型肝炎严重程度的相关性

目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)表面CD244与程序性死亡蛋白1(PD-1)的共表达模式及其与疾病进展的关系。方法:采集81例CHB患者和14例健康者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC);利用主要组织相容性复合体I(MHC-I)-肽五聚体技术标定HBV表位特异性CTLs;荧光抗体标记细胞表面CD244与PD-1分子,流式细胞术检测。结果:CHB患者CD244与PD-1在HBV特异性CTLs表面共表达较总CD8+T细胞表面明显升高(67.48%±17.16%vs 14.01%±7.97%,P<0.01);HBV感染的不同临床类型中,轻中度的CHB患者HBV特异性CTLs表面CD244与PD-1共表达水平较免疫耐受者明显升高(72.05%±16.86%vs 53.11%±18.05%,P<0.05),肝衰竭组CD244与PD-1共表达水平较轻中度CHB下调(63.11%±13.87%vs 72.05%±16.86%,P<0.05)并伴随干扰素γ(IFN-γ)分泌功能的恢复(30.95%±20.29%vs 13.63%±10.46%,P<0.01)。结论:CHB患者HBV特异性CTLs细胞表面高共表达CD244与PD-1分子,CD244与PD-1共表达在CHB不同临床类型中有差异,并与IFN-γ分泌水平呈负相关,提示CD244可能与CHB患者HBV特异性CTLs功能低下及CHB疾病进展相关。

狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排后在小鼠神经母细胞瘤细胞中的表型分析

【目的】探究狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排对基因转录和蛋白表达的影响,揭示病毒在小鼠神经母细胞瘤(NA)细胞中的表型变化与M基因重排的相关性。【方法】通过荧光定量PCR、Western blot以及病毒在NA细胞中的生长和扩散试验,对亲本毒株rHEP-Flury和M基因重排毒株M2、M4在NA细胞中的基因转录、表达、生长和扩散进行比较。【结果】狂犬病病毒结构基因的转录和表达主要受病毒基因组RNA合成的影响,但是在一个完整转录过程中单个结构基因的转录比例与其所在位置相关,M基因重排病毒的Leader RNA(LeRNA)和L mRNA的转录比例显著高于亲本毒株rHEP-Flury。M基因重排病毒在NA细胞中的生长和扩散都劣于亲本毒株rHEPFlury。【结论】狂犬病病毒亲本毒株rHEP-Flury具有狂犬病病毒原始的基因组顺序,在NA细胞中的生长和扩散都明显优于M基因重排病毒。结构基因在基因组中的位置主要决定其在一次转录过程中的转录比例,进而影响病毒在NA细胞中的生长和扩散。

阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎过程中乙型肝炎病毒基因型变化情况分析

目的研究阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)过程中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型变化情况。方法选取16例应用ADV治疗的CHB患者作为研究对象,用一片段PCR法扩增了用药前(baseline,BL)、用药后第28周、52周、92周时的HBV全基因组,克隆后进行全基因组序列测定及基因型分型。结果16例CHB患者治疗开始时(baseline,BL)的HBV基因型分布为:B型9例,C型7例,未发现A、D、E、F基因型。但有5例患者在接受ADV治疗后的28周、52周、92周,基因型发生了变化即从B型变为C型,或从C型变为B型。结论本研究发现,在ADV治疗CHB过程中,31.25%患者体内的HBV基因型发生了变化。这种变化产生的原因及其生物学意义,有待于进一步研究。

人文关怀护理在提高卵巢癌患者生活质量及改善心理状态中的作用

目的评价人文关怀护理在提高卵巢癌患者生活质量及改善心理状态中的作用。方法选取2014年9月—2018年8月收治的卵巢癌患者共计122例,按照随机数字表法分为观察组和对照组,每组61例,观察组给予人文关怀护理措施,对照组给予常规护理措施,观察并比较2组患者治疗后生存质量评分、心理状态评分以及不良反应的发生情况。结果对照组生活质量中各项指标评分均优于对照组,差异具有统计学意义(P <0. 05)。治疗前2组患者焦虑自评量表和抑郁自评量表评分相比,差异不具有统计学意义(P> 0. 05);治疗后,2组焦虑自评量表和抑郁自评量表评分均有改善,治疗后观察组与对照组心理状态评分相比,差异具有统计学意义(P <0. 05)。2组患者治疗后不良反应的发生率相比,差异具有统计学意义(χ2=4. 3399,P <0. 05)。结论对卵巢癌患者采用人文关怀护理措施可明显提高患者生活质量,改善患者心理状态,降低不良反应的发生率,值得在临床上予以推广。

狂犬病病毒G蛋白的过表达及对病毒的抑制

【目的】探究G蛋白在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)复制中的作用,以揭示携带双G基因的重组RABV的Hep-dG与亲代毒株rHep-Flury在神经母细胞瘤(NA)细胞中滴度差异的原因,为RABV致病机制的研究奠定基础。【方法】通过病毒吸附、入侵、荧光定量PCR、Western-blot以及中和抗体阻断等试验,检测G蛋白过表达对IFN-β以及相关因子转录的影响。【结果】Hep-dG感染能显著上调NA细胞中IFN-βmRNA的表达,激活了下游因子STAT1的表达与磷酸化,在较低的感染复数(MOI=0.01)下,Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β基因的表达,36 h达到最高水平(P<0.001)。该病毒进入细胞后,产生了更多的病毒Leader RNA和RIG-I mRNA,且与IFN-βmRNA的表达高度一致。抗体阻断IFN-β后,Hep-dG在NA细胞中的病毒滴度显著上升(P<0.01),约为阻断前的7.9倍,且与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。与阴性对照比较,5μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P<0.05),表明真核表达RABV G蛋白能在一定程度上刺激IFN-β的转录。【结论】本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用。RABV G蛋白的过表达,通过促进病毒Leader RNA的转录,激活了RIG-I介导的IFN-β通路,进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。G蛋白的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。

狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排在小鼠致病性和保护性研究

目的了解M基因重排对病毒致病性和免疫保护性的影响,从而为狂犬病疫苗的开发提供更适合的候选株。方法将病毒rHEP-Flury和M基因重排株颅内接种1~3 d龄的乳鼠,测定病毒在乳鼠上的半数致死量(LD 50)。将rHEP-Flury和M基因重排株以103、104和105 FFU免疫接种6~8周龄的成鼠,然后用标准攻毒株CVS-24进行颅内感染小鼠,测定小鼠的存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清抗体水平。结果狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排后,病毒对乳鼠的毒力随着M基因位置远离病毒启动子位置增强,即M2<rHEP-Flury<M4。当接种剂量为104和105FFU时,M基因重排对病毒在成鼠上的保护性没有统计学意义影响;当接种剂量为103FFU时,M基因重排病毒对小鼠的保护性明显高于rHEP-Flury。结论狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排能够降低病毒对乳鼠的毒力,提高对小鼠的保护性,为狂犬病疫苗开发奠定基础。

炙枇杷叶对2型糖尿病咳嗽患者血糖的影响

本文通过对2021年至2022年期间,符合诊断标准的2型糖尿病患者并因上呼吸道感染愈后出现单独咳嗽患者研究分析,探讨炙枇杷叶对2型糖尿病咳嗽患者血糖的影响。对入选病例常规服用降糖药维持不变,分为观察组和对照组。对照组入院后未使用炙枇杷叶颗粒剂连续5天的空腹血糖及餐后2小时血糖,观察组则在对照组的基础上使用炙枇杷叶颗粒剂干涉。结果显示:使用炙枇杷叶颗粒剂的观察组患者的血糖低于对照组患者的血糖。差异有统计学意义(p﹤0.05)。由此可知:炙枇杷叶对2型糖尿病咳嗽患者的血糖有降低的效果。

核酸扩增技术及其在动物检疫中的应用、挑战与对策

核酸扩增技术是一种在生物技术领域广泛使用的技术,可通过特定的方法将DNA或RNA片段扩增至百万倍甚至更高倍数,从而检测和识别这些片段。核酸扩增技术包括多种方法,如实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、数字PCR技术(digital PCR,dPCR)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)等。在动物检疫方面,通过对动物体内特定病原体的核酸进行扩增,可以快速、准确地检测出该病原体,并采取相应的防控措施;通过对动物源性食品中的病原微生物进行核酸扩增,可以检测出食品中的细菌、病毒等有害物质,保证食品的安全性。随着技术的发展,核酸扩增技术将更加自动化、高通量和快速,灵敏度和特异性将进一步提高。随着微流控技术和纳米技术的发展,核酸扩增技术将变得更加便携,与人工智能、大数据等技术结合,实现智能化和信息化检测,多学科交叉将成为核酸扩增技术发展的重要趋势,有助于推动该技术的创新和应用。

广州地区人腺病毒5型血清中和抗体阳性率初步调查

目的评估广州地区人群中人腺病毒5型(HAdV-5)中和抗体阳性率情况。方法采用以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的人重组腺病毒5型载体,运用化学发光法,检测209份免疫功能正常的成人血清样本中HAdV-5的中和抗体。结果 HAdV-5中和抗体的阳性率为82.3%(172/209)。HAdV-5中和抗体在<1:20(低滴度)、1:40-1:160(中滴度)、1:320-1:1280(高滴度)、>1:1280(超高滴度)时均能检测到,而且随着滴度的增加,阳性率逐渐升高。在20～40岁时HAdV-5中和抗体阳性率最高,在<20岁时HAdV-5阳性率最低。结论广州地区人群中针对HAdV-5的先存中和抗体阳性率高,应用基于该种DNA病毒作为载体进行基因疫苗及基因治疗的研究时,具有一定的局限性。

广州地区人腺病毒5型血清流行病学初步调查

目的评估广州地区人群中人腺病毒5型(HAdV-5)先存中和抗体的流行情况。方法采用以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的人重组腺病毒5型,使用化学发光法,检测了209份免疫功能正常的成人血清样本中HAdV-5的中和抗体阳性率情况。结果 HAdV-5中和抗体的阳性率为82.3%(172/209)。HAdV-5中和抗体在<1/20(低滴度)、1/40-1/160(中滴度)、1/320-1/1280(高滴度)、>1/1280(超高滴度)时均能检测到,而且随着滴度的增加,阳性率逐渐升高。在20～40岁时HAdV-5中和抗体阳性率最高,在<20岁时HAdV-5阳性率最低。结论广州地区人群中针对HAdV-5的先存中和抗体阳性率高,应用基于该种DNA病毒作为载体进行基因疫苗及基因治疗的研究时,具有一定的局限性。

3种猪腹泻相关病原核酸液相芯片检测方法的建立

为建立同步检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)3种腹泻相关病原体的快速高通量检测方法,本研究利用Lumeinex技术原理,建立三重液相芯片方法。结果显示,该方法可准确检出TGEV、PEDV和PDCoV 3种猪腹泻病原,与猪轮状病毒、口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、非洲猪瘟病毒等常见猪病病原无交叉反应;三重液相芯片方法对TGEV、PEDV和PDCoV核酸的检测灵敏度分别为33.2 pg/μL、163 pg/μL和12.1 pg/μL。应用该方法与荧光RT-PCR方法对52份临床样品同时检测,结果符合率为100%。研究结果表明,所建立的三重液相芯片方法可准确检测TGEV、PEDV和PDCoV,具有良好的特异性和敏感性。

非洲马瘟病毒RT-RAA快速检测方法的建立

根据GenBank中非洲马瘟病毒结构蛋白VP7的编码基因序列,针对不同血清型间VP7中的保守序列设计引物和探针,建立非洲马瘟病毒核酸的RT-RAA检测方法,并对引物和探针浓度进行优化,确定最佳反应浓度。然后对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示:本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法在42℃恒定温度下20min能够有效检出目标基因片段,与其他马属动物疫病病原及重要经济动物疫病病原核酸无交叉反应,对非洲马瘟病毒阳性质粒的检测灵敏度达到102 copies/μL,重复性好。利用建立的非洲马瘟病毒RT-RAA检测方法对收集的88份马血清、10份马全血和4份非洲马瘟病毒模拟阳性样本进行检测,检测结果与OIE推荐的荧光RT-PCR检测结果一致。本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA方法特异性强、敏感性高、稳定性好,在20 min内就能够检出样本中非洲马瘟病毒核酸,适用于非洲马瘟病毒核酸的快速检测。

建立及应用高通量液相芯片方法检测鉴别四种动物源性成分

根据GenBank中反刍动物、禽、猪和鱼线粒体DNA序列,分别设计特异性引物和探针,建立同时检测反刍动物、禽、鱼三大类物种和猪成分的四重液相芯片方法,并对其特异性、敏感性和重复试验稳定性进行验证评估。结果显示该方法能够准确检出鉴别4种目标物种,与非目标物种无交叉反应;对DNA模板检测低限可达到0.01~0.05 ng;组间检测变异系数小于20%。应用该方法检测195份饲料和肉类食品,有37份样品检出结果与标注信息不一致,经与现行标准方法比对,两者检测结果一致。研究结果表明,所建立的四重液相芯片方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度高,能够精准检出饲料等加工产品中反刍动物、禽、猪和鱼成分。

骨科护理管理工作中的难点与对策

目的:探讨骨科护理管理工作中的难点与对策。方法:选取在医院骨科任职的40名护理人员为对象,其中2015年1月～2016年6月未实施骨科护理管理的护理人员为实施前,2016年7月～2017年12月实施骨科护理管理的护理人员为实施后。对实施前后护理人员的工作质量及有关静脉血栓的知识掌握程度进行比较。结果:护理管理后,实施后的工作质量有明显提高,其中对静脉血栓的知识掌握程度也有显著提高,数据比较差异显著(P<0.05)。结论:对医院在骨科任职的护理人员进行护理管理,其护理管理对护理人员的工作质量及对静脉血栓的知识掌握程度有明显促进作用。

建立多重液相基因芯片方法快速检测狐狸、水貂成分

基于xMAP液相芯片新型生物技术平台,分别以狐狸线粒体DNA D-loop区序列、水貂线粒体DNA细胞色素b基因序列为模板设计特异扩增引物和探针,并对探针进行锁核酸修饰,建立了二重xMAP液相基因芯片方法,用于快速检测狐狸和水貂源性成分。该法能准确鉴定鉴别狐狸和水貂DNA,对其他18种动物物种DNA均呈检测阴性,对狐狸、水貂DNA的检测低限分别为2.8pg/μl、0.9pg/μl,对肉类混样检出限为0.05%(m/m)。对目标源性DNA含量为1%(V/V)的32份饲料与食品核酸添加样本均呈对应目标检测阳性。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品与饲料领域相关原料和产品的质量与安全检验。

中医药特色护理在骨科护理服务中的应用价值

目的:探讨骨科护理服务中采用中医特色护理的效果。方法:选取2017年10月~2019年11月在医院治疗的112例骨科患者为研究对象,根据简单随机化法分为观察组和对照组,每组56例。对照组采取常规护理,观察组在对照组的基础上实行中医药特色护理,比较两组的护理满意率、并发症发生率、护理后不同时间的视觉模拟评分(VAS)、匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)以及创面愈合时间、住院时间。结果:观察组的满意率为96.43%,高于对照组的82.14%(P<0.05);观察组的并发症发生率为5.36%低于对照组的17.86%(P<0.05);观察组术后3d、1周、2周、3周的VAS评分均低于对照组(P<0.05);观察组的创面愈合时间、住院时间均低于对照组(P<0.05);观察组术后不同时间的PSQI评分均低于对照组(P<0.05)。结论:骨科患者采用中医特色护理可有效降低并发症的发生,减轻疼痛,促进创面快速愈合,有助于提升护理满意率,护理效果显著。